古尼拟青霉镇静催眠活性物质结构的研究

摘要

古尼拟青霉(PaecilomycesgunniiLiang)是古尼虫草(Cordycepsgunnii(Berk.)Betk)的无性型，是一种具有很高药用价值、应用前景广泛的真菌。本研究对古尼拟青霉菌株液体发酵菌丝体的有效成分进行了分析，筛选出活力强的优势菌株，以此菌株为后续实验材料，其菌丝粉经过乙醇提取后，再由石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇依次萃取，所得提取物，经动物实验筛选出镇静促眠效果最显著的提取物，在此基础上将初筛出的提取物经硅胶层析柱进一步分离纯化，经动物实验筛选镇静效果最显著的纯化物，通过紫外光谱，液相质谱和核磁共振分析，确定该物质的结构。具体内容主要包括：高产优质古尼拟青霉菌株的筛选；活性组分的筛选及活性化合物的分离；活性化合物的纯度鉴定和结构解析。
　　 对十株古尼拟青霉菌株的液体发酵菌丝体中所含蛋白质、胞内多糖、甘露醇、麦角甾醇、腺苷等成分以及生物量分别进行了分析测定。依据实验结果，筛选出生物量高，次级代谢产物多，生长速率快的菌株作为实验材料。
　　 将筛选出的古尼拟青霉菌株液体发酵菌丝体经乙醇提取后，分别由石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇依次萃取，以镇静催眠作为主要药效学指标，通过小鼠镇静催眠模型和阈下剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠实验，检测古尼拟青霉菌丝体提取物镇静催眠活性。实验结果显示古尼拟青霉液体发酵菌丝体的四种提取物中正丁醇提取物的镇静催眠活性较之其他三种提取物有较强的活性。
　　 根据以上镇静催眠模型的筛选结果，选取古尼拟青霉液体发酵菌丝体的正丁醇提取物为分离纯化组分。利用高效液相色谱、液质联用、柱层析系统等分离纯化方法，将正丁醇提取物分离为6个组分，用Ⅰ-Ⅵ表示。以镇静催眠为主要药效学指标，通过小鼠镇静催眠模型，检测该6个组分的镇静促眠效果。实验结果显示Ⅰ号组分镇静效果最为显著。
　　 利用高效液相，Ⅰ号组分分离得到四种化合物，分别以pg-1、pg-2、pg-3和pg-4区分表示。以镇静催眠为主要药效学指标，通过小鼠镇静催眠模型，检测该四种化合物的镇静促眠效果。实验结果显示pg-3镇静效果最为显著。用HPLC法和UV法对pg-3纯度进行分析，初步判断pg-3为纯品。对pg-3进行高分辨质谱检测，分子量为：452.23003。与已知数据库比对，可初步推断pg-3的分子式为C20H32N6O4S1。同时对其进行核磁共振分析，得出化合物C20H32N6O4S1的结构式：精氨酰-苯丙氨酰-甲硫氨酸。且经过小鼠镇静催眠模型，pg-3具有显著镇静作用，表明该活性化合物的制备是成功的，活性没有丢失。
　　 此外，研究了古尼拟青霉的十株菌株培养特性，观察了菌落形态，测定了产孢量和其粗蛋白，多糖，甘露醇，麦角甾醇，腺苷等主要活性成分含量。发现不同菌株具有不同的形态特征，且形态特征与其产孢量及主要活性成分存在一定内在联系。
　　 并以古尼拟青霉生物量和麦角甾醇含量为指标，对古尼拟青霉的高产麦角甾醇培养条件及麦角甾醇提取工艺进行了优化。正交试验结果表明，高产麦角甾醇的最适液体培养基：蔗糖4％，麸皮2％，KH2PO40.025％，NaCl0.05％；响应面实验结果表明麦角甾醇最佳提取工艺为：提取溶剂浓度为80％乙醇，液料比为200:1，提取时间为65min。为进一步的古尼拟青霉开发利用提供参考。