蛋白激酶DNA-PKcs与PLK1分别通过调节核酸酶EXO1及CtIP介导DNA损伤修复

摘要

DNA双链断裂(DNA double strand breaks，DSB)发生后，研究发现有三个主要因素能调控损伤修复方式：细胞类型、细胞所处周期以及受损DNA末端剪切（End Resection）的发生。电离辐射（Ionizing radiation，IR）预处理真核细胞发生DSB后，非同源末端连接（NHEJ）修复灵敏、快速以及不需要特定的染色体形态，是细胞DNA修复的主力军，但是 NHEJ修复容易出错；而同源重组修复（HR）不能直接连接DNA末端，需要剪切一小段损伤处5′端的DNA链，同时它还需要同源模板，故被限制在S期和G2期才能激活，却因此也使得DNA修复较为精确。　　而EXO1和CtIP蛋白正是HR通路中的关键性核酸酶，末端剪切首先由MRN复合体识别DNA断裂末端，协同CtIP外切酶在DNA的3′端切割出较短的悬链；接着招募EXO1等外切酶从5′端方向对悬链进一步剪切至10 kb左右，阻止末端 DNA被 DNA-PKcs和Ku70/80构成的DPK复合物结合，从而激活HR通路，完成精确修复。在此理论基础上，我们可以通过调控核酸酶 EXO1和 CtIP来介导DNA损伤修复。　　目的：(1)研究IR诱导DNA双链断裂损伤后，讨论DNA-PKcs不仅可作为NHEJ通路的核心因子，同时也能调控HR通路关键性蛋白EXO1的稳定性，介导HR和NHEJ通路选择的分子机制。(2)预测同源重组通路关键性核酸酶 CtIP相互作用蛋白并进一步研究其相互作用。　　方法：(1)通过对细胞加入DNA-PKcs特异性抑制剂抑制激酶活性或 siRNA特异性敲低 DNA-PKcs表达后，采用免疫共聚焦荧光（IF），免疫印迹（western blot），RT-PCR以及流式细胞仪等技术手段检测细胞中不同修复通路关键蛋白如EXO1等的变化，研究其调节机制。(2)在PrePPI在线数据库中寻找 CtIP相互作用蛋白，挑选感兴趣的蛋白进行验证和研究；使用免疫共沉淀方法（Co-IP）验证两者的相互作用，分别构建 CtIP和需要验证蛋白的截断体寻找相互作用位点；利用Frodock2.0工具对接两者相互作用；最后用IF实验观察CtIP与互作蛋白在细胞内共定位的情况。　　结果：(1)在细胞中加入DNA-PKcs特异性抑制剂后，提取染色体蛋白，从 Western blot结果可见抑制 DNA-PKcs活性或敲低DNA-PKcs表达可以影响 HR通路；细胞中提前加入 NU7441和NU7026处理6 h和8 h后，EXO1的蛋白表达水平增多；CHX和泛素化实验中证明 DNA-PKcs活性抑制可以引起 EXO1蛋白半衰期延长，使其蛋白稳定性增加，同时 EXO1泛素化也相应减弱；TDR双阻滞同步化细胞后，检测 EXO1蛋白在 G0/G1期蛋白表达弱，而DNA-PKcs(s2056)位点磷酸化加强；与其同时，抑制DNA-PKcs激酶活性，也能影响同步化细胞里的EXO1的泛素化程度。(2)在 PrePPI在线数据库中寻找核酸酶 CtIP相互作用蛋白，知晓了 PLK1是预测分数排名靠前的作用蛋白；内外源验证了 CtIP和 PLK1蛋白能在细胞里形成蛋白复合物；分别构建 PLK1和 CtIP蛋白的截断体进一步验证了两者的相互作用，PLK1的KD（Kinase结构域）段、Middle段可与CtIP发生免疫共沉淀，而CtIP则是通过N端的（17-160）氨基酸残基区域与PLK1蛋白反应。Frodock2.0工具显示CtIP均可与PLK1全长、N端和C端不同截断体形成对接。　　结论：(1) DNA-PKcs可以通过调节自身激酶活性影响EXO1的泛素化降解过程，从而负调节 EXO1蛋白的稳定性；同时敲低DNA-PKcs的表达也能影响 EXO1蛋白水平变化，提示 DNA-PKcs可通过激酶活性及蛋白表达调控EXO1介导选择HR和NHEJ通路。(2)从生物信息学、分子生物学、细胞生物学和结构生物学等角度，我们证明了蛋白激酶 PLK1可以与核酸酶 CtIP蛋白发生相互作用，并且根据 PLK1与 CtIP相互作用的大致区域，说明两者可能共同参与了DNA损伤修复调节和细胞周期调控。

目录

声明

英文缩略词

第一部分 DNA-PKcs对同源重组通路关键性核酸酶EXO1的调节机制

第1章 绪 论

第2章 材料与方法

第3章 结果与讨论

第4章 结论

参考文献

第二部分 核酸酶CtIP与PLK1蛋白相互作用的机制探讨

第1章 引言

第2章 材料与方法

第3章 结果与讨论

第4章 结 论

参考文献

综述:EXO1蛋白的功能探讨

攻读学位期间的科研成果

致谢