猪TAP1基因多态性及其与断奶仔猪免疫指标的相关性分析

摘要

本研究以安徽地方优良猪种（皖南黑猪、圩猪、霍寿黑猪、安庆六白猪）和外来品种大白猪为材料，研究抗 F18大肠杆菌的候选基因之一，TAP1基因的单链核苷酸多态性（single nucleotide polymerphisms，SNPs）及其与断奶仔猪部分免疫指标的相关性。根据GenBank猪TAP1（登录号BX323833）序列设计引物，采用PCR-SSCP技术检测 TAP1全部基因编码区11个外显子区域的遗传变异，筛查 SNPs位点分析其多态性，并运用SPSS程序中的GLM模型分析所检测到的遗传变异与部分血清免疫指标的关联性。旨在寻找地方猪种中可以作为抗 F18大肠杆菌或者一般抗病性的有效遗传标记，为安徽省地方猪种质资源特性及MAS研究提供分子生物学参考。经研究发现：
　　（1）TAP1基因的84bp在霍寿黑猪群体中检测到 T→C突变，其他四个群体在该位点没有检测到突变；该基因的443bp在试验的5个群体中均检测到G→A突变；该基因的6297、6298bp在圩猪、皖南黑猪和霍寿黑猪群体中检测到 G→C、G→T突变，安庆六白猪和大白猪种没有检测到；该基因的7570bp在5个群体中均检测到G→A突变。
　　（2）TAP1基因84bp处突变为错义突变，使编码的氨基酸由色氨酸变成了精氨酸，在霍寿黑猪中检测到三种基因型（AA、AB和 BB），其中 AA（野生型）基因型频率为67.32％，AB基因型频率24.84%，BB（突变性）基因型频率为7.84%。霍寿黑猪的多态信息含量（PIC）为0.2709，在该位点处于中度多态，在其他四个群体中均没有检测到该突变位点，均为野生型。TAP1基因443bp处突变为无义突变，没有引起氨基酸的改变，在圩猪、皖南黑猪、安庆六白猪、霍寿黑猪和大白猪群体中均检测到了三种基因型（CC、CD、DD），其中 CC（野生型）基因型频率在这5个群体中分别为9.21%、12.63%、17.24%、62.09%、10.92%，CD基因型频率分别为31.58%、25.26%、31.03%、29.41%、29.31%，DD基因型频率分别为59.21%、62.11%、51.72%、8.5%、25.57%。上述5个群体的多态信息含量（PIC）分别为0.3047、0.3063、0.3435、0.2929、0.3082，在该位点均处于中度多态。TAP1基因6297bp和6298bp处突变为连锁突变，前者使编码的氨基酸由谷氨酰胺变成了组氨酸，后者由缬氨酸变成了亮氨酸。在圩猪、皖南黑猪、霍寿黑猪群体中均检测到两种基因型（EE和 EF），其中 EE基因型频率在这3个群体中分别为79.18%、66.67%、92.16%，EF基因型频率分别为20.83%、33.33%、7.8%。圩猪、皖南黑猪、霍寿黑猪的多态信息含量（PIC）分别为0.1706、0.2409、0.0725，在该位点均处于低度多态。在安庆六白猪和大白猪群体中没有检测到该突变位点，均为野生型。TAP1基因7570bp处突变为无义突变，没有引起氨基酸的改变。在圩猪、皖南黑猪、安庆六白猪、霍寿黑猪和大白猪群体中均检测到了三种基因型（GG、GH、HH），其中其中GG（野生型）基因型频率在这5个群体中分别为17.97%、7.80%、7.97%、11.76%、6.45%，GH基因型频率分别为40.76%、32.62%、12.50%、33.33%、23.82%，HH基因型频率分别为41.27%、59.53%、79.53%、54.90%、69.73%。上述5个群体的多态信息含量（PIC）分别为0.3611、0.2991、0.2142、0.3242、0.2535，其中安庆六白猪在该点位处于低度多态，其他均处于中度多态。
　　（3）χ2检验表明：T84C位点在霍寿黑猪中显著偏离 Hardy-Weinberg平衡状态（P?0.05），G443A位点在皖南黑猪和大白猪种中显著偏离 Hardy-Weinberg平衡（P<0.01），G7570A位点在安庆六白猪中显著偏离 Hardy-Weinberg平衡（P<0.01），其余各位点在检测到的群体中均处于 Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）。
　　（4）品种间各免疫指标差异分析：IL-6在安庆六白猪的含量显著高于大白猪（P<0.01）；IL-12在圩猪的含量显著低于安庆六白猪和大白猪（P<0.05）；IFNγ在圩猪中的含量显著高于安庆六白猪和大白猪（P<0.01），在大白猪中的含量显著高于安庆六白猪（P<0.01）；TNFα在大白猪中的含量显著低于安庆六白猪和圩猪（P<0.01）。
　　（5）G443A位点各品种内免疫指标相关性分析：圩猪中，GG基因型个体IL-6 IFNγ和TNFα含量显著高于GA基因型（P<0.05）；大白猪种AA基因型个体IL-10含量显著高于GA基因型（P<0.05）。
　　（6）G7570A位点各品种内免疫指标相关性分析：在安庆六白猪中，AA基因型个体 IL-10含量显著高于 GA基因型（P<0.05）；大白猪中 GA和 AA基因型个体IFNγ含量显著高于GG基因型（P<0.05）。
　　研究结果提示：TAP1基因G443A位点、G7570A位点有可能作为有效靶位点应用于霍寿黑猪、安庆六白猪、圩猪和大白猪抗F18大肠杆菌育种。

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缩略词(Abbreviation)

第一章文献综述

1品种介绍

1.1霍寿黑猪简介

1.2圩猪简介

1.3安庆六白猪简介

2大肠杆菌简介

2.1大肠杆菌F18致病机理

2.2 F18大肠杆菌研究进展

3猪抗病性相关候选基因

3.1 FUT1基因

3.2 TLRs基因

3.3猪主要组织相容性抗原（SLA）基因

3.4干扰素基因

4 TAP基因简介

4.1 TAP的结构

4.2 TAP的转运机制

4.3 TAP的多态性与表达调控

5细胞因子概述

5.1白细胞介素-6概述

5.2白细胞介素-10概述

5.3白细胞介素-12概述

5.4 干扰素-γ概述

5.5肿瘤坏死因子-α概述

引言

第二章猪TAP1基因编码区多态性分析

1试验材料

1.1试验动物

1.2主要仪器

1.3主要试剂

1.4主要试剂配制

2试验方法

2.1 DNA提取

2.2 DNA浓度和纯度检测

2.3软件分析工具

2.4引物设计

2.5 PCR反应体系

2.6琼脂糖凝胶电泳检测

2.7单链构象多态性检测（SSCP）

2.9群体遗传学分析

2.10遗传多样性分析

2.11群体遗传结构分析

3结果与分析

3.1猪基因组DNA的检测

3.2 PCR扩增结果

3.3 PCR-SSCP检测结果

3.4 TAP1序列分析结果

3.5 TAP1基因型频率和基因频率分析

3.6群体遗传学分析

4讨论

第三章TAP1基因多态性与断奶仔猪部分免疫指标关联分析

1试验材料

1.1试验动物

1.2试验设备和器材

1.3试验耗材和试剂

2试验方法

2.1试验原理

2.2操作步骤

2.3操作顺序总结

2.4结果判定及计算

2.5数学分析模型

3结果与分析

3.1各猪种间免疫指标差异性分析

3.2 TAP1基因多态性与断奶仔猪免疫指标的关联性分析

4讨论

结论

参考文献

致谢

作者简介

攻读硕士研究生期间发表论文