抗PEDV高免卵黄抗体的制备及其初步应用

摘要

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED)是由冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起猪的一种高急性、传染性肠道病毒病。此疫病的流行和传播，已严重影响到我国养猪行业的发展。当前疫苗免疫是防治我国猪群PED的主要手段，但效果不佳，且该病在治疗方面尚无特效药物。目前，仔猪流行性腹泻在全国各大小猪场频繁发生。疫情以发病快、传播迅速、范围广、发病率高、死亡率高、造成损失严重等特点，主要侵染1周龄左右的产房仔猪，发病率最高达100％，死亡率90%以上。患病仔猪病症常表现为：精神抑郁，嗜睡，食欲不振，脱水，身形消瘦，被毛粗乱，粪便呈黄色、黄白色以及棕色水样从肛门排出，呕吐时常伴有未消化的凝乳块。剖检后观察到的病理变化主要有：肠系膜、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结肿大出血，肠内多为腥臭的黄色或者褐色液体。本病的发生，给新生仔猪的存活带来严重威胁，使养猪业损失惨重。为了制备抗PEDV高免卵黄抗体并探究其在仔猪PED防治中的应用效果，开展了如下三方面的研究：
　　1.抗PEDV高免卵黄抗体如何制备的研究。本次研究采用RT-PCR检测结果为阳性的仔猪整段小肠，制成PEDV油乳剂灭活抗原用于蛋鸡的免疫，利用本实验室已建立ELISA方法检测卵黄抗体水平，并以此为标准收集抗体水平最高时间段的鸡蛋。继续采用琼脂扩散法收集抗体效价大于26的高免蛋，利用酸化水法提取卵黄抗体液，经无菌安全试验后实际用于仔猪PED的防治。
　　2.抗PEDV高免卵黄抗体用于仔猪PED治疗效果的研究。本次研究，分别选取江苏盐城、安徽长丰、安徽阜南三家猪场各70、139、160头30日龄内PEDV呈阳性的腹泻仔猪作为治疗对象。分为自然发病，抗生素、补液盐治疗和卵黄抗体治疗三组，其中自然发病116头，抗生素、补液盐治疗94头，卵黄抗体治疗159头。结果显示：自然发病组仔猪存活率仅为9.4%；采用抗生素、补液盐治疗组存活率达到了17%；而采用卵黄抗体治疗组存活率高达79.9%，说明抗PEDV高免卵黄抗体治疗仔猪PED效果显著。且治疗中发现，病程越短，发病日龄越高的仔猪治疗效果越好。卵黄抗体治疗仔猪与自然发病对照仔猪相比，体内排泄的病毒量呈显著减少趋势，粪便由恶臭水样至膏状至固体颗粒状，精神、食欲恢复，不再呕吐腹泻直至痊愈。
　　3.抗PEDV高免卵黄抗体用于仔猪PED预防效果的研究。本次研究，选取正在爆发PED的安徽长丰某猪场12小时内新生未感染PEDV仔猪85头；安徽阜南某猪场12小时内新生未感染PEDV仔猪29头作为预防对象。其中，卵黄抗体预防组62头，对照组52头。结果显示，抗PEDV高免卵黄抗体预防组发病率为9.8%，存活率为96.8%；对照组发病率为59.6%，存活率为46.2%。说明采用抗PEDV高免卵黄抗体对新生仔猪进行预防，能很大程度降低仔猪感染PEDV的概率，从而保证新生仔猪的存活率。
　　但抗PEDV高免卵黄抗体在实际临床防治应用中的效果，可能会受到仔猪自身疾病，病情发展状况，猪场饲养管理及防疫措施等各方面因素的影响。因此我们在应用抗PEDV高免卵黄抗体防治仔猪PED的同时，要做好前期诊断工作，在调查完全后适当使用卵黄抗体液，使其达到最好的防治效果，为防治仔猪PED提供一种高效、方便的途径。

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文献综述

1 猪流行性腹泻

2 卵黄抗体

1 引言

1.1 研究目的和意义

1.2 国内外研究现状

1.3 研究内容和方法

2 材料

2.1 病料

2.2 主要仪器及设备

2.3 主要试剂及配制

2.4 PEDV特异性引物

2.5 实验动物

3 试验方法

3.1 PEDV油包水乳剂免疫抗原的制备

3.2 免疫抗原的性状检测

3.3 蛋鸡的免疫程序及方法

3.4 抗体效价的测定

3.5 卵黄抗体的提取

3.6 卵黄抗体的性状检测

3.7 抗PEDV高免卵黄抗体用于临床PED治疗

3.8 仔猪肛拭子PEDV荧光定量PCR检测

3.9 抗PEDV高免卵黄抗体PED预防

3.10 数据处理

4 结果

4.1 仔猪肠组织病样PEDV的RT-PCR结果

4.2 PEDV阳性混合病样十倍稀释RT-PCR结果

4.3 PEDV油乳剂免疫抗原的制备及性状检测结果

4.4 抗PEDV卵黄抗体水平变化趋势

4.5 卵黄抗体提取结果

4.6 PEDV高免卵黄抗体性状检测结果

4.7 抗PEDV高免卵黄抗体治疗试验结果

4.8 抗PEDV高免卵黄抗体用于患病仔猪治疗前后粪便变化情况

4.9 抗PEDV高免卵黄抗体用于患病仔猪治疗前后猪群健康状况

4.10 采用荧光定量 PCR技术实时检测发病仔猪肛拭子携带 PEDV病毒量结果

4.11 抗PEDV高免卵黄抗体预防试验结果

5 讨论

5.1 禽免疫抗原的选择与制作

5.2 抗PEDV高免卵黄抗体如何获得

5.3 卵黄抗体治疗效果及实际操作应注意问题

5.4 卵黄抗体预防PED的可行性及前景展望

结论

参考文献

致谢

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