几种颚口线虫线粒体基因组序列测定及系统发育研究

摘要

颚口线虫（Gnathostoma spp.）是严重危害公共卫生的食源性人兽共患寄生虫，由该虫引起的病例呈世界性分布，其中热带和亚热带地区是发病的主要区域。患者主要通过食用生鱼、青蛙、蛇和未煮熟的鸡等食物而感染。颚口线虫通过侵入人体的胃肠道，破坏皮肤和中枢神经系统，可能导致蛛网膜下腔出血和嗜酸性粒细胞减少，甚至会导致脑膜炎，引起致命的永久性神经功能损伤。目前，已经报道可引起人体颚口线虫病的虫种主要有6种:棘颚口线虫（G.spinigerum）、杜氏颚口线虫(G.doloresi)、日本颚口线虫（G .nipponicum）、马来颚口线虫（G.malaysiae）、刚刺颚口线虫(G.hispidum)和双核颚口线虫（G.binucleatum）。准确的鉴定和分类是对颚口线虫病进行诊断、治疗及控制的基础。线粒体基因组序列的稳定组成、序列保守、少重组及进化率高等优势，使其成为研究寄生虫分类、遗传变异及系统进化发育的重要分子标记。然而目前对于颚口线虫线粒体基因组的研究非常少，仅有1种颚口线虫的线粒体基因组序列被解码报道。
　　本研究对来自不同国家、地区的颚口线虫，通过长PCR方法扩增出其完整的线粒体基因片段，并通过引物移步法测出完整的4组线粒体基因组序列，分别为中国杜氏颚口线虫（G.doloresi China isolate）13，809bp、日本杜氏颚口线虫(G.doloresi Japan isolate)13，812bp、日本颚口线虫（G.nipponicum）14，093bp和韩国未知种颚口线虫(Gnathostoma sp.Korea isolate)14，391bp，其GenBank注册号分别为KU975390、KX231806、KX826911和KX826912。这4组线粒体基因组序列均含有12个蛋白质编码基因，2个rRNA基因和22个tRNA基因，共36个基因。其基因排列顺序及转录方向与已报道的有棘颚口线虫相同。4组线粒体基因组序列差异各不相同，不同虫株之间的差异为14.4％-18.2％。在12个蛋白质编码基因中，起始密码子多为TTG、ATA、ATG和ATT，终止密码子多为TAG和TAA，但其中一部分基因使用了不完整终止密码子TA和T。
　　本研究分别对3种（共4个虫株）颚口线虫及其他20种虫株线粒体基因组的12个蛋白质编码基因氨基酸串联序列进行贝叶斯(BI)系统发育分析，结果表明杜氏颚口线虫与有棘颚口线虫的亲缘关系更近，而日本颚口线虫与韩国未知种颚口线虫的亲缘关系较日本颚口线虫与有棘颚口线虫亲缘关系更近，且韩国未知种颚口线虫完全不同于其他已知颚口线虫，有可能是一个新种。本研究制作的系统发育进化树中也清晰地呈现展示出颚口线虫与其他种属之间的遗传及系统发育关系。
　　本研究解码的4株颚口线虫线粒体基因组序列，均为世界首次解码分析。所得数据对研究颚口线虫分子流行病学、系统发育学和群体遗传学均提供了宝贵的序列资源，为建立颚口线虫的诊断、检测方法提供了新的遗传标记，对有效预防和控制颚口线虫病具有重要意义。

目录

声明

致谢

摘要

插图和附表清单

缩写和符号清单

文献综述

引言

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 样品来源

1．1．2 主要仪器设备

1．1．3 试剂和酶

1．1．4 溶液配制

1．1．5 培养基配制

1．1．6 相关生物信息学软件及在线网址

1．2 实验方法

1．2．1 虫体总DNA提取

1．2．2 引物设计与合成

1．2．2 线粒体全基因组DNA的PCR扩增

1．2．3 PCR产物的回收与纯化

1．2．4 PCR纯化产物的连接

1．2．5 重组质粒的转化及鉴定

1．2．6 序列测定

1．3．2 线粒体基因的定位及注释

1．3．3 线粒体基因组生物信息学分析

1．3．4 系统发育分析

2 结果与分析

2．1 PCR扩增结果

2．2 测序结果及序列拼接

2．3 颚口线虫线粒体基因组的基本特征

2．3．1 杜氏颚口线虫中国株(Gnathostoma doloresi China isolate)线粒体基因组的基本结构和特征

2．3．2 日本杜氏颚口线虫(Gnathostoma doloresi China isolate)线粒体基因组的基本结构和特征

2．3．3 日本颚口线虫(Gnathostoma nipponicum)线粒体基因组的基本结构和特征

2．3．4 韩国未知种颚口线虫(Gnathostoma species Korea isolate)线粒体基因组的基本结构和特征

3 讨论

3．1 颚口线虫比较线粒体基因组学研究

3．1．1 颚口线虫线粒体基因组的大小

3．1．2 颚口线虫线粒体基因组的基因

3．1．3 颚口线虫线粒体基因组核苷酸组成

3．1．4 颚口线虫线粒体基因组起始密码子和终止密码子的使用

3．1．5 颚口线虫线粒体tRNA和rRNA二级结构

3．1．6 颚口线虫密码子使用偏性

3．2 颚口线虫系统发育研究

结论

参考文献

附录

作者简介