同种异体脂肪干细胞对SD大鼠移植脂肪早期微血管形成影响的初步研究

摘要

皮肤组织的创伤修复及再生是烧伤整形外科中常见问题及挑战，尤其对于软组织缺损的修复。目前临床常用的修复方法有适用于缺损程度轻微患者的激光治疗，但疗程长、效果不稳定、易有色素沉着；牛胶原、自体胶原蛋白、透明质酸等生物材料填充具有操作简单、损伤小及见效快的优点，但对于缺损程度轻微的患者维持时间短暂、费用高和材料渗漏等不足；对于缺损面积较小患者用手术切除缝合，术后可能留有明显瘢痕；能较好改善外形的皮瓣技术，需要较高的手术技巧同时存在供区损伤。自体脂肪相对于其他生物填充材料具有组织相容性好、无异物排异反应的优势。作为一种理想的软组织填充剂的自体颗粒脂肪移植术具有操作简单方便、供区损伤小等优点。但是大量研究表明：目前临床上的非血管化的自体颗粒脂肪移植，早期因有大量的脂肪细胞对缺血、缺氧的耐受力差而死亡，导致中远期疗效很不稳定，严重影响了这一极具潜力技术的发展和进步。因此，如何改善移植脂肪的血供、提高脂肪细胞因对缺血、缺氧的耐受力就成为关键因素。　　近期有报道显示组织固有的干细胞或祖细胞可以向脂肪细胞及内皮细胞分化[24]。因此通过增加脂肪来源的间充质干细胞(Adipose-derived stem cells, ADSCs)促进移植物脂肪组织早期细胞增殖和血管化，来提高移植脂肪成活率成为关注的热点。尤其是干细胞辅助移植技术(cell-assisted lipotransfer, CAL)的发明为更好的应用脂肪移植提供了新的思路。脂肪来源的间充质干细胞作为种子细胞可广泛用于辅助移植。但自体ADSCs来源有限、体外培养周期长等原因严重限制了其应用。有研究表明：异体ADSCs具有低免疫原性，而且能够诱导免疫耐受[58]。近期在小鼠及兔用同种异体脂肪干细胞辅助颗粒脂肪移植，认为在促进移植物存活及血管化的同时，未见明显免疫排斥。但异体脂肪干细胞对SD大鼠移植脂肪早期微血管作用如何，具体的作用机制至今未见相关报道。因此本研究采用异体干细胞辅助自体脂肪移植的方法，在SD大鼠上进行脂肪移植探索性实验，试图证明异体干细胞能够通过提高移植物早期血管化来缩短 SD大鼠脂肪组织缺血缺氧时间，从而提高脂肪移植物的存活率，为后续的深入研究提供初步的动物实验数据资料和实验可靠证据。　　本实验首先采用胶原酶消化法进行SD大鼠ADSCs体外分离培养，原代细胞呈长梭状及漩涡样生长，混有未贴壁球形或圆形杂细胞；第4代细胞生长较统一，杂细胞少。细胞生长曲线可见第4代ADSCs大约3天进入对数生长期，同时第10代细胞较第4代生长缓慢。ADSCs诱导多向分化潜能经茜素红染色后可见棕褐色钙结节，油红O染色可见红色脂滴。流式细胞仪鉴定免疫表型中CD106、CD45呈阴性，CD34、CD49d呈阳性表达。其次将雄性 SD大鼠32只，按随机数字表法分为4组：A组为异体AG（adipose granule, AG），B组为自体AG，C组为自体ADSCs复合自体AG组，D组为实验组：异体ADSCs复合自体AG。将混合好的脂肪移植于SD大鼠背部皮下，于移植后1周分别取出移植脂肪组织，脂肪移植物湿重D(0.35±0.04)、C(0.36±0.03)组与A(0.252±0.04)、B(0.265±0.03)组有比较明显差异（P＜0.05)；免疫组化CD31阳性细胞数D(22.08±1.03)、C(20.53±1.07)显著高于A(7.97±3.61)、B(10.93±1.68)组（P＜0.05）。　　本研究结果表明：　　①. SD大鼠ADSCs体外分离培养取得成功；　　②.异体ADSCs复合自体AG在SD大鼠上可提高脂肪移植物的成活率；　　③.异体脂肪间充质干细胞在皮下注射移植脂肪组织中有绿色荧光的分布；　　④.异体 ADSCs与自体干细胞辅助脂肪颗粒移植一样能够促进移植物脂肪早期血管化程度。脂肪湿重上细微差别，仍然具有统计学意义。　　结论：①.异体干细胞辅助自体脂肪移植的方法适用于SD大鼠脂肪移植实验研究；②.异体ADSCs复合自体AG在SD大鼠上可显著性提高脂肪移植的成活率；③.其作用机制可能是通过提高移植脂肪组织早期血管化程度，缩短SD大鼠脂肪组织缺血缺氧时间。

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同种异体脂肪干细胞对SD大鼠移植脂肪早期微血管形成影响的初步研究

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