相同基因型与不同基因型丙型肝炎病毒二次感染的比较性分析研究

摘要

目的：　　构建携带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）或带红色荧光蛋白（mCherry）的丙型肝炎病毒（HCV）细胞感染性毒株,并利用带荧光标记的活病毒研究相同型与不同基因型HCV二次感染的病毒表达效应，探索HCV基因型对二次感染的影响。　　方法：　　化学合成加入EGFP或mCherry基因片段，克隆入HCV全长基因组中，获得带加入EGFP/mCherry的病毒质粒，通过酶切鉴定、基因测序鉴定成功后，体外转录获得RNA，同时将带有报告基因的质粒J6/JFH1-EGFP，J6/JFH1-mCherry进行体外转录后,转染人肝癌细胞系Huh7.5细胞,通过荧光显微镜检测EGFP/mCherry表达情况。取其病毒上清液去感染新的Huh7.5细胞，分别收集活病毒，测定其不同天数下的病毒滴度。据病毒滴度结果进行二次感染Huh7.5细胞，即是用相同基因型或不同基因型的病毒同时感染细胞，或是一种基因型感染细胞后再24h后用另一种基因型继续感染，利用荧光显微镜观察感染细胞情况并对各组的二次感染受感染细胞数进行对比分析。　　结果：　　成功构建带EGFP或带mCherry的HCV细胞感染性克隆5a-EGFP、5a-mCherry。将病毒J6/JFH1-EGFP，J6/JFH1-mCherry、5a-EGFP、5a-mCherry RNA转染Huh7.5细胞内可检测到EGFP/mCherry表达，收集病毒转染细胞的培养上清液具有感染活性，能感染新的细胞。测定各病毒不同天数的病毒滴度，结果显示在病毒转染后的第7、9、11天HCV感染细胞数≥80％时病毒J6/JFH1-EGFP滴度分别为104.05FFU/ml、104.14FFU/ml、104.21FFU/ml，J6/JFH1-mCherry的病毒滴度分别为103.79FFU/ml、103.64FFU/ml、103.62FFU/ml。而在转染后的第9、11、13天HCV感染细胞数≥80%时病毒5a-EGFP滴度分别为104.64FFU/ml、104.74FFU/ml、105.00FFU/ml。5a-mCherry的病毒滴度分别为104.27FFU/ml、104.16FFU/ml、104.52FFU/ml，以上提示上述病毒RNA转染的细胞能释放有传染性的HCV病毒颗粒。据滴度结果J6/JFH1-EGFP、J6/JFH1-mCherry选择第7天，5a-EGFP、5a-mCherry选择第9天的转染细胞培养上清液进行二次感染。发现HCV二次感染的基因型差异包括在荧光显微镜下观察活细胞的感染情况和各基因型病毒在细胞中的感染分布差异性，在同种基因型的J6/JFH1-EGFP与J6/JFH1-mCherry或同种基因型的5a-EGFP与5a-mCherry的二次感染可见EGFP、mCherry共表达，而不同基因型病毒J6/JFH1-EGFP/mCherry与5a-EGFP/mCherry的二次感染未见荧光表达。　　结论：　　构建带EGFP或mCherry报告基因的HCV毒株在肝癌细胞中可得到表达。探索性研究发现同种基因型的HCV二次感染可能更利于在肝癌细胞中存活及病毒表达,为HCV治疗和特异性抗HCV药物评价系统的建立提供新思路。

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英文缩略词表

0引言

1材料和方法

1.1材料

1.2 方法

2 结果

2.1 质粒J6/JFH1-EGFP、J6/JFH1-mCherry和YL21的双酶切处理

2.2重组质粒5a-EGFP、5a-mCherry的酶切鉴定

2.3 序列测定结果

2.4 质粒 J6/JFH1-EGFP 和 J6/JFH1-mCherry、5a-EGFP 和 5a-mCherry 在Huh7.5细胞中的表达

2.5 病毒滴度测定

2.6 二次感染Huh7.5细胞

3 讨 论

4 结论

参考文献

综述:HCV培养系统的研究进展及应用

作者简历

致谢

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