二甲双胍联合柔红霉素对人结肠癌细胞(SW480)增殖及凋亡的影响

摘要

目的：　　(1)观察二甲双胍联合柔红霉素对人结肠癌细胞(SW480)的增殖抑制作用及促进细胞凋亡作用，并探讨其可能的作用机制。　　(2)观察二甲双胍联合柔红霉素对人结肠癌细胞(SW480)荷瘤裸鼠的抑瘤作用。　　方法：　　(1)体外培养SW480结肠癌细胞，通过MTT法检测不同浓度二甲双胍(2.5、5、10、20、40、80mmol·L-1)、柔红霉素(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8μmol·L-1)以及不同浓度二甲双胍(2.5、5、10、20、40、80mmol·L-1)联合柔红霉素(0.2μmol·L-1)在不同时间(24h、48h、72h)对结肠癌SW480细胞增殖的影响，确定药物的浓度和作用时间。实验分为四组：空白组，二甲双胍组(20mmol·L-1)，柔红霉素组(0.2μmol·L-1)，二甲双胍与柔红霉素联合用药组(20mmol·L-1+0.2μmol·L-1)，药物作用24h后检测相应指标：①MTT法检测细胞存活率；②集落克隆形成法检测细胞集落克隆形成情况；③碘化丙啶(propidium iodide,PI)单染及Annexin V/PI双染法检测细胞的凋亡率；④Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白的表达；⑤RT-PCR检测细胞Bcl-2、Bax mRNA变化。　　(2)动物实验使用人结肠癌SW480细胞，建立移植肿瘤裸鼠模型：选取5-6周健康裸鼠，待细胞生长至对数期时，调整细胞浓度为1×107/ml，每只裸鼠左侧腋窝下注射细胞悬液0.2ml，将40只荷瘤小鼠随机分为4组：模型组(生理盐水 NS)，二甲双胍组(100mg·kg-1)，柔红霉素组(0.1mg·kg-1),二甲双胍组与柔红霉素联合用药组(100mg·kg-1+0.1mg·kg-1)，以上各组裸鼠腹腔注射给药，每只0.2mL，每隔3天给药一次，给药6次，处死裸鼠，检测相应指标。①测量瘤体大小，绘制成瘤曲线；②称量瘤体湿量，计算抑瘤率；③HE染色观察瘤体转移浸润情况；④TUNEL检测细胞凋亡情况；　　结果：　　(1)体外细胞实验：①MTT法检测显示，不同浓度二甲双胍(2.5、5、10、20、40、80mmol·L-1)、柔红霉素(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8?mol·L-1)作用于SW480细胞24h、48h、72h后均可降低细胞的存活率。两者合用时，对细胞的生长抑制率明显增加，且抑制作用具有浓度、时间依赖性。20mmol·L-1二甲双胍作用于细胞24h、48h、72h后的存活率分别为66.35％、50.37%、42.02%。0.2?mol·L-1柔红霉素作用于细胞24h、48h、72h后的存活率分别为63.12%、48.13%、45.24%。二甲双胍与柔红霉素(0.2-1)合用作用于细胞24h、48h、72h的存活率分别为60.63%、45.29%、32.16%。明显低于各单用组(P<0.05)。②集落克隆结果显示，在经过结晶紫染色以后，克隆处显示为紫色斑点，而细胞经二甲双胍和柔红霉素单独用药及联合用药组处理后，与空白组比较，集落克隆形成数量均有所减少，差异有统计学意义(P<0.05)，进一步观察两者合用后，联合用药组与柔红霉素单用组比较，克隆形成的斑点减少更加明显，差异有统计学意义(P<0.05)。③PI单染及Annexin V/PI双染经流式细胞仪检测显示：SW480细胞的自发凋亡率极低，在用药以后，二甲双胍和柔红霉素单独作用于细胞后凋亡率增加，两者合用作用于细胞后，细胞凋亡率明显增加，与空白组比较差异均具有显著性(P<0.05)，与柔红霉素单用组相比，联合用药组细胞凋亡率明显增加，差异均具有显著性(P<0.05)。④Western blot及RT-PCR结果显示，Bcl-2蛋白及mRNA的表达，与空白组比较，各组表达量减少，差异具有显著性(P<0.05)；与柔红霉素单用组比较，联合用药组表达量明显减少，差异具有显著性(P<0.05)；Bax蛋白及mRNA的表达，与空白组比较，其他各组表达量均增加，差异具有显著性(P<0.05)；与柔红霉素单用组比较，联合用药组表达量明显增加，差异具有显著性(P<0.05)；　　(2)动物实验：①联合用药组的瘤体积、生长与单用组比，生长缓慢，体积缩小，差异具有显著性(P<0.05)。瘤体湿重及计算抑瘤率。结果显示，与模型组相比，柔红霉素组与联合用药组瘤重有明显减少，差异具有统计学意义(P<0.05)，与柔红霉素组相比，联合用药组瘤重减少的更明显，差异具有统计学意义(P<0.05)。②HE染色，在血管最丰富处即肿瘤的最外层，联合用药组同其他组相比，细胞正常区域较少，而坏死区域较多。③TUNEL检测凋亡细胞，镜下显示联合用药组细胞凋亡最为明显。　　结论：　　(1)二甲双胍联合柔红霉素对人结肠癌SW480细胞增殖有抑制作用并能促进细胞凋亡，其作用机制可能与促进 Bax蛋白表达，抑制Bcl-2蛋白表达有关。　　(2)二甲双胍联合柔红霉素对SW480结肠癌荷瘤裸鼠有抗肿瘤增长作用，其机制可能与促进凋亡有关。

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1 材料与方法

1.1材料

1.2 方法

2.结果

2.1药物对结肠癌细胞SW480增殖抑制的作用

2.2药物对结肠癌细胞SW480集落克隆形成的抑制作用

2.3溴化吡啶 (propiodide, PI)单染检测细胞凋亡率

2.4 Annexin V/PI 双染检测细胞凋亡

2.5 Western blot检测Bax和Bcl-2蛋白的表达

2.6 RT-PCR检测相关基因的表达

2.7二甲双胍联合柔红霉素对裸鼠移植肿瘤抑制作用的影响

3.讨论

4.结论

参考文献

综述：结肠癌的发病机制及治疗药物的研究进展

作者简历

致谢

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