SARS-CoV S DNA疫苗诱导的记忆性T细胞及S蛋白T细胞表位的研究

摘要

严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)，又称传染性非典型肺炎，是一种新出现的传染性疾病。2003年4月16日，WHO正式宣布引起SARS的病原体是一种全新的冠状病毒，并命名为SARS冠状病毒(SARScoronavirus，SARS-CoV)。研究发现，SARS-Cov包含四种主要的结构蛋白，分别为S蛋白、M蛋白、N蛋白及E蛋白。其中，S蛋白主要与易感细胞表面受体结合，诱导病毒包膜与靶细胞膜间的融合，而且其基因序列相对保守，是SARS疫苗研发的理想靶标。目前正在研制的SARS疫苗包括：灭活疫苗、核酸疫苗及蛋白疫苗等类型。其中，以SARS-CoV S蛋白为基础的核酸疫苗是目前研究的热点。 研究表明SARS病毒感染机体或者疫苗免疫以后，可以诱导中和抗体产生，体液免疫应答在机体抗SARS病毒感染中发挥重要作用。但是，SARS病毒感染或者疫苗免疫是否也能同时诱导细胞免疫应答的产生，参与细胞免疫反应的细胞亚群的表型特征如何，细胞免疫在体内能否长期维持等问题仍然不清楚。在文章的第一章，我们发现使用SARS-Cov S DNA疫苗免疫小鼠可以同时诱导细胞和体液免疫应答，并且使用SARS-CoV S DNA疫苗加强免疫可以提高抗原特异性细胞免疫应答的强度。其次，根据IFN-γ和IL-2的表达情况，CD4<'+>T抗原特异性T细胞可分为3个明显亚群：IFN-γ<'->IL-2<'+>，IFN-γ<'+>IL-2<'+>和IFN-γ<'+>IL-2<'->；而CD8<'+>T细胞只存在2个明显亚群：IFN-γ<'+>IL-2<'+>和IFN-γ<'+>IL-2<'->。此外，sARS-covs DNA疫苗经肌肉免疫以后，诱导的抗原特异性IFN-γ<,'+>细胞以CD8<'+>T细胞为主，且多分布在非淋巴器官(如肺)；而经皮下免疫以后，诱导的抗原特异性IFN-γ<,'+>细胞以CD4<'+>T细胞为主，主要分布在局部淋巴结。最后，我们发现使用SARS-CoVs DNA疫苗诱导的抗原特异性IFN-γ<,'+>和IL-2<,+>T细胞都不表达CD62L，而几乎所有的表达IL-2的CD4<"+>和CD8<'+>T细胞均表达CD127，属于记忆性细胞。大部分(60-75﹪)的CD8<'+>IFN-γ<,'+>T细胞都不表达CD127，属于效应性T细胞。文献报道，以SARS—CoV S蛋白或者S蛋白的受体结合区(RBD)为基础的疫苗，在诱导机体产生保护性免疫应答的同时，会引起肺部的损伤。而多肽疫苗能够在诱导有效的体液和细胞免疫应答的同时尽量减少蛋白疫苗诱导的免疫病理作用。在文章的第二章，我们围绕着SARS-CoV S蛋白T细胞表位肽的筛选，表位肽免疫原性的检测等方面展开实验。我们使用部分氨基酸重叠的SARS-CoV S多肽库，最终筛选出四条H-2<'d>限制性表位肽：N50、N60、P141和P152。其中，N50和P141特异性的作用于CD8<+>T细胞，N60和P152特异性作用于CD4<'+>T细胞。N50和N60位于RBD，且分别诱导CD4<'+>和CD8<'+>细胞产生IFN-γ，的作用强于P141和P152，属于优势表位。同时，我们发现N50不能诱导SARS-CoV S DNA疫苗免疫的C57BL/6小鼠的脾细胞产生IFN-γ，而N60却能诱导C57BL/6小鼠的CD8<'+>T细胞产生IFN-γ。此外，我们发现N50和N60能够有效的刺激记忆性T细胞分泌IFN-γ。而且使用N50和N60与佐剂CpG加强免疫小鼠，能够明显的提高体内IFN-γ<'+>和/或IL-2<'+>抗原特异性细胞的含量。 细胞毒性T细胞表位(CTL epitope)是蛋白抗原经抗原递呈细胞(Antigenprocess cell，APC)加工处理，继而与MHC I类分子结合并最终提呈给T细胞受体(TCR)识别，引起有效免疫应答的短肽。在文章的第二章，我们发现N50(S365-374)能诱导SARS-CoV S DNA疫苗免疫：BALB/c小鼠脾细胞中的CD8<'+>T细胞分泌IFN-γ，含有CTL表位。然而，在这个CTL表位中，哪些位点是决定其功能的主要位点?在文章的第三章中，我们合成不同长度的N50片段并分别使用酸碱性不同的丙氨酸(A)、赖氨酸(K)和天冬氨酸(D)对N50(S365-374，KCYGVSATKL)上的残基进行单个氨基酸置换，观察突变多肽刺激抗原特异性细胞产生IFN-γ能力。结果表明去掉N50“N”端首位氨基酸“K”，或者使用不同性质的氨基酸对其进行置换，均不会明显影响多肽的功能。此外，使用丙氨基酸“A”替代S365-374第6位“S”丝氨酸，也不会影响多肽的功能。而其他突变多肽片段诱导IFN-γ产生的能力均下降。因此，推断S366-374(CYGVSATKL)是SARS-CoV S蛋白的一个CTL表位，其中第2，9位的“Y，L”为可能为其主要的锚着残基。综上所述，本研究从不同角度出发着重研究了SARS．CoV S DNA疫苗免疫机体诱导的抗原特异性细胞免疫的特征，特别是研究了其诱导的记忆性T细胞的特征。同时，本研究不但鉴定了四条SARS S抗原的H-2<'d>限制性表位肽，而且证明了其中两条主要表位肽具有体内活性。我们的研究为新型SARS疫苗的设计和应用提供了宝贵的实验依据，必将极大地推动SARS疫苗的研究。

目录

文摘

英文文摘

第一章SARS-CoV S DNA疫苗诱导的记忆性T细胞的特征

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

附图

参考文献

第二章SARS-CoV S蛋白T细胞表位的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

附图

参考文献

第三章SARS CTL表位残基的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

附图

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表和待发表的论文

综述 SARS-CoV S 蛋白表位的研究进展

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