食用油DNA提取方法及转基因成分检测技术的研究

摘要

从古至今，植物源性食用油一直是人类得以健康生活的保证。近年来，许多农业公司利用包括转基因技术在内的现代生物技术开发新的植物品系。由于转基因植物存在的安全性问题使得转基因农作物的标签问题成为公众关注的主要热点，已有30多个国家制定了相应的法律法规对转基因作物及其衍生产品进行标签。目前，许多未经标签和认证的转基因生物及其深加工产品可能已经进入中国市场，这就迫切地需要合适的检测手段以确定这些食品中是否含有转基因成分。 以油脂为材料提取 DNA 进行分子生物学研究的关键是能否提取到高质量的油脂DNA。自DNA分析技术兴起后，国内外在这方面做出了巨大的成就，发展了多种转基因食品DNA检测方法。但仍存在以下问题：①各种提取方法通用性不好。在许多实验中存在扩增成功率在物种和食品种类之间的差异。虽然专用DNA提取试剂盒有较好的通用性，但昂贵的价格限制了该试剂盒的广泛应用，因此构建一套效果好、通用性好、性价比高的油脂DNA提取方法，可以大大推进油脂DNA技术的推广。②对外源基因最佳PCR检测方法的摸索，检验灵敏度和效率都不高。 本文以4种植物油为材料，分别构建了2种新的DNA提取方法解决现存的问题；分别用普通PCR和降落PCR检测转基因成分，并对其反应体系和条件进行优化，主要结果如下： 1、本论文中构建的改进型CTAB提取方法广泛适用于各种植物油DNA提取，仅一次提取即得到高质量的模板DNA，成功率高，一般不需重复提取，对PCR产物的扩增结果也证实了方法的可靠性和通用性。虽然有些公司的油脂DNA提取专用试剂盒也有着较好的通用性，但其昂贵的价格(25元/次)使其在大量分析样品时受到很大的限制。与之相比，本方法成本低廉，每提取一个样品的成本低于 3 元，用实验室常用试剂即可完成油脂DNA提取，同时产物纯度高于专用试剂盒。即拥有超过专业试剂盒的提取效果，又尽可能的降低了实验成本，真正实现了实验室通用性，有利于油脂DNA技术的迅速推广。 2、本研究中还利用快速蛋白液相色谱法(Fast protein liquid chromatographyFPLC)，通过阴离子交换柱分离纯化DNA，提高了产物的纯度，关键是可以把完整基因组DNA与DNA片断分开，同时节省了提取时间，回收率高，适宜少量样品的快速DNA提取。 3、通过优化实验对普通PCR法检测外源基因进行分析，得出以下最佳反应条件：①Mg<,2+> 浓度为 2.5mmol/L、引物浓度为 0.1μmol/L．至0.4μmol/L、dNTPs 浓度200μmol/L，Taq酶添加量为5U。最佳退火温度为54.8℃(CaMV35S)和53.2℃(NOS)。 4、通过优化实验对降落PCR法检测外源基因进行分析，并与普通PCR法作比较，证明了TD-PCR明显提高了普通PCR检测特异性和效率，更大程度上避免了假阳性产物的存在，可提供一种比普通PCR更可靠灵敏的转基因成分定性检测方法。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第1章前言

1、转基因作物的发展现状

2转基因产品的安全性问题

2.1转基因产品的安全性问题引起争议

2.2转基因产品的潜在危害

2.3有关国家对转基因产品的标识管理制度

3食品中DNA提取及鉴定进展

3.1核酸分子的特性

3.2分离与纯化核酸的原则和要求

3.3 DNA的提取和纯化

4转基因产品的主要检测方法

4.1转基因产品的检测策略

4.2外源基因的检测

4.3外源蛋白质的检测方法

4.4小结

5本论文立论背景

第二章高纯度油脂DNA提取通用方法的建立

1材料和方法

1.1样品的采集

1.2仪器

1.3试剂

1.4方法

2.结果与分析

2.1不同DNA提取方法提取结果的紫外吸收值比较

2.2不同方法提取DNA的电泳检测结果

2.3不同提取方法对DNA PCR扩增的影响

2.4 CTAB法不同处理提取纯化DNA结果

3讨论

3.1改进型CTAB法提取油脂DNA

3.2方法核心技术

3.3提取方法的通用性

第三章FPLC法从油脂中提取高质量DNA方法的建立

1引言

2材料和方法

2.1样品的采集

2.2仪器

2.3试剂

2.4方法

3结果及分析

3.1 FPLC方法学考察结果

3.2 FPLC色谱条件的优化结果

3.3 FPLC法分离油脂DNA的结果

4讨论

第四章转基因成分PCR及降落PCR检测技术的研究

1引言

2材料和方法

2.1样品的采集

2.2仪器

2.3试剂

2.4试验方法

3结果与分析

3.1提取、扩增结果

3.2 PCR体系优化结果

3.3 PCR增强剂的选择和优化结果

3.4 PCR反应退火温度的优化

3.5油脂外源基因降落PCR的效果

3.6降落PCR扩增的灵敏度检测

4讨论

4.1影响PCR反应的因素及解决方法

4.2假阳性

4.3TD—PCR适用于转基因的外源DNA的检测

第五章总结

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢