纳米羟基磷灰石海藻酸钙胶原复合物骨修复材料的生物相容性及动物实验研究

摘要

各种因素所致的骨缺损修复是临床上的难题之一。传统的修复方法包括自体骨移植和同种异体骨移植，但这两种方法均存在一定的缺陷。自体骨组织材料来源有限，供骨的形状和结构与植骨区难相配匹，且有增大手术创伤和并发症的风险，使用受到一定限制。同种异体骨移植有不可避免的免疫排斥反应，同时也存在个体差异、骨源受限、传播疾病等问题。 随着医学（尤其是组织工程科学）的发展，组织工程骨在修复骨缺损方面起着重要的作用。传统组织工程骨一般需在体外预制成型，经手术植入体内，往往带来额外创伤和并发症。随着外科微创化的发展，对可注射可塑性人工骨修复材料的研究日益受到人们的重视。 本课题将海藻酸钙、纳米羟基磷灰石及胶原按一定比例复合，制成一种可注射、可任意塑形并且具有良好骨传导、骨诱导性的复合骨修复材料。前期的实验证明该复合材料具有良好的理学性能，能满足临床用骨的要求；但是，骨修复材料仅仅能满足临床应用时所需的理化性能是不够，还需有良好的生物相容性及骨修复能力，确保其临床应用的安全性和有效性。本研究通过海藻酸钙纳米羟基磷灰石胶原复合物与兔骨髓间充质干细胞共培养实验和海藻酸钙纳米羟基磷灰石胶原复合物修复兔桡骨缺损实验，来了解其生物相容性及骨修复能力。 第一部分纳米羟基磷灰石海藻酸钙胶原复合物材料与兔骨髓基质细胞的体外生物相容性的研究。 目的： 检验纳米相羟基磷灰石海藻酸钙胶原复合材料（nano-Hydroxyapatite/Collagen/Calcium Alginate，n-HACCA）与兔骨髓基质干细胞（BMSCs）的相容性。 材料及方法： （一）材料2周龄健康新西兰大白兔，DMEM/F12、D-Hank's，胰蛋白酶，胎牛血清，双抗，山羊抗小鼠-Cy3，山羊抗小鼠-FITC，CCK-8试剂盒，CO2培养箱，荧光显微镜，流式细胞仪，扫描电镜，WellScan MK22型酶标仪。纳米羟基磷灰石海藻酸钙胶原复合材料。 （二）采用从兔骨髓提取骨髓间充质干细胞进行原代培养及传代培养，通过大体观察及流式细胞仪检测来鉴定所培养的细胞。 （三）通过倒置显微镜、电镜扫描来观察细胞在n-HACCA材料上的生长情况，并且通过CCK-8试剂盒来比较A组（对照组，纯细胞培养）与B组（实验组，n-HACCA材料与细胞共培养）细胞的生长情况。 结果： （一）兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）的培养与鉴定 1．原代培养的BMSCs细胞48h内大部分贴壁，细胞呈形态较一致的短梭形、多边形，5～7d时可见明显集落形成，增殖速度快，2周左右细胞互相融合，细胞呈成纤维细胞样，排列呈螺旋状、鱼群状或漩涡状。传代培养的BMSCs贴壁很快（12h内大多数细胞已贴壁），呈长梭形，形态更加均匀，生长旺盛，7d左右即可达到90％融合，10d左右生长逐渐缓慢。 2．BMSCs表面抗原：发现在绝大多数细胞中，骨髓基质细胞特征标志的CD29和CD44阳性，而作为造血干细胞特征标志的CD34和CD45阴性，提示BMSCs经上述方法分离传代至第5代时，已经基本纯化。具体结果：CD29阳性率为99．62％，CD44阳性率为94．28％；CD34阴性率为99．80％，CD45阴性率为99．57％。 （二）纳米羟基磷灰石海藻酸钙胶原复合物材料（n-HACCAA）与兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）共培养的观察结果。 1．n-HACCA/BMSCs共培养的倒置显微镜观察由于材料是不透光的，故材料表面的细胞情况在倒置显微镜下观察很困难。在n-HACCA材料的周围可观察有细胞附着，随培养时间延长，附于材料上的细胞逐渐伸展贴壁。 2．n-HACCA/BMSCs共培养的SEM观察复合培养5d时，见n-HACCA材料的表面和孔隙内均有细胞附着，细胞已伸展成梭形或多角形，伸出伪足粘附材料上。细胞表面可见大量的微绒毛，表示细胞状态良好。 3．CCK-8法检测n-HACCA材料上细胞增殖情况从细胞活度OD值所绘制的生长曲线来看，细胞接种后，n-HACCA和空白组随时间延长细胞活性逐渐增加，仍可保持正常的分裂增殖速度，两组之间相比未见显著性差异（P>0．05）。 结论： 兔骨髓基质干细胞能在纳米羟基磷灰石海藻酸钙胶原复合材料上良好地粘附、增殖、生长，细胞的活性未受到纳米羟基磷灰石海藻酸钙胶原复合物材料的影响，纳米羟基磷灰石海藻酸钙胶原复合物材料具有良好的细胞相容性。 第二部分：纳米羟基磷灰石海藻酸钙胶原复合物材料修复兔桡骨缺损的实验研究。 目的：探讨纳米羟基磷灰石海藻酸钙胶原复合物材料植入动物体内的成骨能力。 材料与方法： （一）材料3月龄健康新西兰大白兔18只，制备兔桡骨中段1．5 cm骨缺损模型。海藻酸钙纳米羟基磷灰石胶原复合材料。 （二）方法按随机数字表法将模型兔分为2组，实验组和对照组，每组9只。实验组兔桡骨缺损部位植入藻酸钙纳米羟基磷灰石胶原复合材料，对照组为空白对照，不植入任何材料。术后观察动物的一般情况，于术后4、8、12周分别处死每组3只动物，取出标本，行大体观察、X射线观察和组织学检测缺损部位的成骨情况。 结果：纳入动物18只，均进入结果分析，无脱落。 1．术后1、2 d所有兔精神、饮食稍差，活动少，无畏寒发热征象，全身未见皮疹。手术伤口无红肿、渗液等。3 d后精神好转，饮食正常，活动增加。 2．骨缺损部位大体标本观察术后各时间点，手术区材料周围组织层次清楚，无明确肿胀、粘连等炎症征象。术后4周，骨断端与材料结合紧密，无明显缝隙，材料开始降解，材料有类骨样组织充填，有一定强度。术后8周，骨断端与材料界限不明显，材料完全被类骨样组织充填，强度较大。术后12周，材料骨化，质地硬，与正常骨无明显差异（图1）。空白对照组，术后4周骨断端见骨膜反应，8周断端成纤维化，无骨生成12周断端骨质硬化。 3．X射线拍片观察4周时实验组桡骨缺损区可见明显的骨生成影像，呈云雾状，均匀分布在骨缺损区，其密度较低，大量空隙存在；8周时X线显示植入体已与缺损断端骨性愈合，皮质骨连续性差；12周时，植入体已与缺损处断端骨性愈合，皮质骨连续性较好，髓腔通畅。空白对照组各时间点均显示骨缺损区尚未修复，留有较大空隙，12周时示骨断端骨质硬化。 4．标本组织学观察实验组各阶段我们可以看到兔桡骨缺损处有不同程度的新骨形成。4周时材料部分吸收而且有纤维组织再生，材料被成纤维细胞和新生脉管包绕，但是象白细胞一样的炎症细胞已经很少了，而且剩余的材料继续被破骨细胞吸收．术后8周，材料内可以看到广泛新生活跃的成骨细胞、编织骨结构、孤立的新生骨以及新生血管。在材料的表面，可以看到板层骨，表明有很强骨重塑能力，材料内可以看到许多骨小梁、骨基质以及类骨髓腔结构．术后12周，材料内的编织骨基新生血管已经消失，缺损处被新生骨填充，这新生骨具有了正常骨的很多特征，例如骨小梁、骨髓腔，在骨髓腔的内膜表面可以看到很多活跃的成骨细胞。 结论：纳米羟基磷灰石海藻酸钙胶原复合骨修复材料具有良好成骨能力。 总结： 1．通过兔骨髓冲洗提取分离培养法能够成功获得骨髓间充质干细胞。 2．纳米羟基磷灰石海藻酸钙胶原复合骨修复材料具有良好生物相容性。 3．纳米羟基磷灰石海藻酸钙胶原复合骨修复材料具有较强的成骨能力。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文名词对照与缩写

声明

研究背景及目的

第一部分 纳米羟基磷灰石海藻酸钙胶原复合物材料与兔骨髓基质细胞的体外生物相容性研究

1 引言

2材料与方法

3 结果

4讨论

5参考文献

6附图和说明

第二部分 纳米羟基磷灰石海藻酸钙胶原复合物材料修复免桡骨缺损的实验研究

1 引言

2材料和方法

3 结果

4讨论

5参考文献

6附图和说明

全文总结

存在的不足及展望

文献综述可注射人工骨的研究进展

在读期间科研成果

致 谢

统计学证明