稻瘟病菌无毒蛋白AVR-PikH4互作水稻蛋白的筛选及其功能分析

摘要

由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）侵染引起的稻瘟病，是水稻生产上的重要限制因素，它具有传播速度快、发生范围广、危害严重等特点，严重威胁着水稻的生产。聚合多个主效抗病基因培育水稻新品种是目前防治稻瘟病最为经济有效的手段，但由于对水稻的抗病基因的具体作用机制缺乏了解及稻瘟病菌生理小种的多样、易变等原因，通过简单聚合几个抗病基因培育的品种抗病效果不明显或在田间推广后会很快失去抗性，导致稻瘟病重新爆发。研究稻瘟病菌无毒基因在水稻中的作用靶标有助于阐明无毒基因的致病机理，揭示植物抗性易丧失的可能机制，为培育持久广谱高抗稻瘟病的水稻新品种的奠定重要理论基础。　　本研究利用酵母双杂交系统，对稻瘟病菌无毒蛋白 AVR-PikH4 的互作蛋白进行鉴定及功能分析，结果如下：　　1、以课题组前期通过空间诱变技术获得高抗稻瘟病水稻株系 H4 接种稻瘟病菌GD0193后不同侵染时期（1 d、2 d、3 d、4 d）的叶片为材料，采用双链特异性核酸酶（duplex-specific nuclease，DSN）均一化技术与SMART（switching mechanism at 5′end of RNA transcript）建库技术相结合的方法，成功构建了稻瘟病菌侵染水稻叶片的均一化酵母双杂交cDNA文库，该文库容量高（2.2×106 cfu/mL），插入片段长度均大于400 bp，均一化效果显著，为节约筛库成本、时间和进一步的文库筛选奠定了基础。　　2、根据基因对基因学说，H4高抗广东致病谱较广的稻瘟病代表菌株GD0193，推测GD0193菌株中存在抗病基因Pik-H4对应的无毒基因AVR-PikH4，为了进一步明确GD0193中是否存在AVR-PikH4并分析它与等位基因AVR-Piks的亲缘关系，我们从稻瘟病菌GD0193中克隆了AVR-PikH4，结果表明该基因的cDNA片段长度342 bp，与AB498879.1序列大小一致，说明稻瘟病菌GD0193拥有AVR-PikH4基因，编码一个12 KDa的小分子分泌蛋白。　　3、为进一步了解无毒基因AVR-PikH4在水稻中所参与的致病途径，我们成功构建了诱饵质粒 pGBKT7-AVRPikH4ΔSP（全长 AVR-PikH4 有自激活活性），该诱饵质粒不存在自激活活性及细胞毒性。进一步利用H4的均一化cDNA文库进行的酵母双杂交筛选结果表明，初级筛选中获得 45 个与 AVR-PikH4 互作的水稻蛋白，利用SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/+X-α-Gal培养基平板上复筛确认了24个互作蛋白。进一步通过PCR测序去掉重复及移码突变的互作克隆，最终获得了15个候选互作克隆，从中挑取可能与致病相关的5个候选互作蛋白，分别将它们的全长cDNA克隆到pGADT7质粒后与 pGBKT7-AVRPikH4ΔSP 进行双杂交验证。结果表明：AVR-PikH4 与LOC_Os06g28590.1、LOC_Os02g46030及LOC_Os06g22960都有直接的相互作用。

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