猪细胞色素P450 1A1的表达调控机制

摘要

我国幅员辽阔，气候多样，霉菌在农业上危害极为严重。霉菌所产生的部分二级代谢产物，如T-2毒素，性质稳定、毒性强，严重危害畜禽养殖、食品安全，进而威胁国民健康。细胞色素P450氧化酶（Cytochrome P450,CYP）是由一组结构和功能相关的超家族基因编码的同工酶，广泛分布于生物体中。它是体内参与各类化合物代谢的关键酶，本实验室前期实验结果表明，鸡CYP1A5能够将T-2毒素进行羟基化代谢，生成低毒产物 3-羟基-T-2，提示我们 CYP1A 家族可以作为潜在的代谢酶靶点，通过诱发其表达对T-2毒素进行代谢转化。因此，明确猪的CYP1A1的表达调控机制是实现该脱毒策略的前提。但是针对CYP1A家族基因的表达调控研究主要集中在阐述多环芳烃、多氯联苯等化合物对人、鼠CYP1A1的诱导调控机制，猪CYP1A1的本底调控机制尚无相关报道，T-2毒素参与猪CYP1A1诱导调控的机理亦未明晰。　　本文首先进行了猪CYP1A1的本底表达调控机制的研究，在猪原代肝细胞中扩增得到了猪CYP1A1基因ATG上游3.6 kb的DNA片段。将启动子片段进行一系列的截短后，与萤火虫荧光素酶基因融合，建立启动子双荧光素酶系统，通过荧光素酶的相对强弱分析，发现猪CYP1A1的本底调控区间为近端启动子区域；利用顺式元件分析软件，对这个DNA片段上的转录因子与顺式元件进行预测分析，在猪CYP1A1近端启动子，找到了参与猪CYP1A1本底调控的两个潜在的关键顺式元件：GC box和异源物质效应元件（XRE），并预测结合这两个顺式元件的转录因子特异蛋白1（Sp1）和芳香烃受体（AhR）。通过将关键碱基突变确认了顺式元件在本底表达中可能发挥的功能。而后我们利用敲降该转录因子和结合实验证明了在近端启动子中，发挥本底转录激活的转录因子为Sp1，进一步通过采用AhR的抑制剂和激动剂处理LLC-PK1细胞后，排除了 AhR 对猪 CYP1A1 近端启动子的本底调控作用，从而明确了 Sp1 在LLC-PK1细胞中对猪CYP1A1的本底调控中发挥关键功能。　　对于T-2毒素诱导猪CYP1A1表达研究中，我们分别从转录水平和表观遗传修饰的角度进行了探索性的研究。首先发现T-2毒素能够强烈激活猪CYP1A1 mRNA与蛋白的表达，采用放线菌素D（Act D）预处理抑制RNA聚合酶活性，确认了T-2毒素主要通过影响转录或转录前过程诱导猪CYP1A1的表达。通过对猪CYP1A1不同截短启动子的活性分析，发现T-2毒素对启动子活性的影响的呈现出序列累积效应，且转录激活水平较低，因此推测T-2毒素对猪CYP1A1的诱导调控可能与DNA甲基化和组蛋白修饰有关。在T-2毒素对猪CYP1A1启动子区间进行表观遗传修饰的初步探索中，发现猪CYP1A1上游区间存在CpG岛，确定了T-2毒素能够显著增强猪CYP1A1启动子区间的DNA甲基化水平；结合实验室前期结果，通过抑制组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化修饰，发现抑制该修饰能够增强猪CYP1A1的表达。　　综上所述，本文主要发现了参与猪CYP1A1本底调控的关键转录因子为Sp1，AhR在启动子近端并未发挥转录激活的功能，完善了CYP1A1本底表达的机制；在T-2毒素诱导 CYP1A1 表达进行了初步的探索，为后续表观遗传学机制的阐释奠定了基础；本研究补充了外源化合物参与CYP1A1诱导表达的研究。

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