干扰DRG神经元中的GluN2A/SHP1复合物对病理性疼痛的抑制作用

摘要

目的：N-甲基-D-天冬氨酸型谷氨酸受体 (NMDARs) 在突触前和突触后膜中均有分布。已有证据表明，脊髓背角中的NMDA受体GluN2A亚基能够结合一种蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases, PTPs)---SHP1；这种分子间的结合参与了炎性疼痛的形成。然而，在背根神经节 (dorsal root ganglion, DRG) 神经元中，GluN2A与SHP1的相互作用及其意义尚不清楚。　　方法：本研究合成一段多肽链 (简称 TAT-pep-GluN2A)，以特异性地阻断GluN2A/SHP1 的分子结合，探讨 GluN2A/SHP1 在痛觉传递和维持过程中的作用；免疫组织化学法观察SHP1在DRG神经元中的分布；免疫印迹和免疫共沉淀法观察TAT-pep-GluN2A对GluN2A/SHP1的结合能力及对GluN2A蛋白酪氨酸磷酸化的影响；全细胞电生理学技术记录脊髓组织片 AMPARs-mEPSCs 的变化，观察外周给予 TAT-pep-GluN2A 对突触前兴奋性谷氨酸神经递质释放的调节作用；动物行为学检测 TAT-pep-GluN2A 对角叉菜胶 (carrageenan)、完全弗氏佐剂 (Complete Freund’s Adjuvant, CFA) 和福尔马林 (Formalin) 诱发的炎性疼痛以及神经损伤(spared nerve injury, SNI)诱发的神经病理性疼痛的影响。　　结果：(1) 免疫组织化学结果显示：SHP1 分布于大鼠 DRG 神经元中，且与 GluN2A 亚基存在相互作用；(2) 大鼠后足底皮下注射角叉菜胶可激活 DRG神经元中的 SHP1；(3) 足底注射的 TAT-pep-GluN2A 多肽链可进入 DRG 神经元的胞体；(4) 免疫沉淀结果显示：大鼠后足底皮下注射角叉菜胶，不仅可以使DRG 神经元中 GluN2A/SHP1 的相互作用增强，同时能提高 GluN2A 亚基的酪氨酸磷酸化水平；(5) 外周给予TAT-pep-GluN2A能够阻断GluN2A与SHP1的相互作用，降低 GluN2A 亚基的酪氨酸磷酸化水平；(6) 电生理学记录结果显示：炎性大鼠外周给予TAT-pep-GluN2A (10 nmol)之后，突触前膜GluN2A对递质释放的调节作用会明显减弱；(7) 行为学结果显示：外周给予 TAT-pep-GluN2A，能够剂量依赖性地缓解角叉菜胶诱发的炎性疼痛；(8) 外周给予TAT-pep-GluN2A ，能够剂量依赖性地抑制 CFA 诱发的炎性疼痛；(9) 外周给予TAT-pep-GluN2A，能够剂量依赖性地抑制福尔马林诱发的双相“自发性”疼痛反应；(10) 外周给予 TAT-pep-GluN2A，能够剂量依赖性地缓解 SNI 诱发的痛觉过敏。　　结论：在 DRG 神经元中，GluN2A 亚基是 SHP1 调节的重要底物；SHP1对 GluN2A 亚基的调节作用参与多种病理性疼痛的形成和维持；外周给予能特异性地阻断GluN2A/SHP1相互作用的多肽链TAT-pep-GluN2A可有效抑制病理性疼痛。

目录

声明

缩略词

第一章 前言

1.1 NMDA受体的生物学特征

1.2 NMDA受体的功能及调节

1.3 NMDA受体与疼痛

1.4 AMPA受体的结构、功能及对痛觉的调控

1.5 蛋白酪氨酸磷酸酶

1.5.1 蛋白酪氨酸磷酸酶的分类

1.5.2 SHP1的结构特征

1.5.3 SHP1的功能及其与疾病的关系

1.6 假设

第二章 实验材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物

2.1.2 实验试剂与器材

2.1.3 抗体与多肽

2.1.4 溶液的配制

2.2 实验方法

2.2.1炎性疼痛模型的建立

2.2.2 选择性神经损伤模型 (SNI) 的建立

2.2.3 背根神经节 (DRG) 的分离

2.2.4 免疫组织化学

2.2.5 免疫共沉淀与免疫印迹

2.2.6 电生理记录

2.2.7 行为学测试

2.3 数据统计

第三章 实验结果

3.1 SHP1在DRG神经元中的分布

3.2外周炎性损伤对SHP1活性的影响

3.3 TAT-pep-GluN2A对DRG神经元中GluN2A的调节作用

3.3.1 DRG神经元中GluN2A与SHP1的相互作用

3.3.2 TAT-pep-GluN2A对DRG神经元中GluN2A/SHP1相互作用的影响

3.3.3 TAT-pep-GluN2A对GluN2A的酪氨酸磷酸化的影响

3.4 TAT-pep-GluN2A对突触前膜谷氨酸递质释放的影响

3.5 TAT-pep-GluN2A对病理性疼痛的抑制作用

3.5.1 TAT-pep-GluN2A对角叉菜胶诱发的炎性疼痛的影响

3.5.2 TAT-pep-GluN2A对完全弗氏佐剂诱发的炎性疼痛的影响

3.5.3 TAT-pep-GluN2A对福尔马林诱发的炎性疼痛的影响

3.5.4 TAT-pep-GluN2A对SNI诱发的神经病理性疼痛的影响

第四章 讨论

4.1 SHP1对痛觉的调控作用

4.2 突触前NMDA受体对痛觉的调控作用

4.3 背根神经节 (DRG) 在痛觉调控中的作用

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

在校期间的研究成果

一、发表论文

二、参与课题

致谢