1.肝再生增强因子(ALR)对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响；2.甲状旁腺激素对骨折愈合有效性和安全性的荟萃分析

摘要

一、肝再生增强因子（ALR）对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响　　目的 探讨肝再生增强因子（Augmenter of liver regeneration, ALR）对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。　　方法 用限制性内切酶Sac I单酶切重组质粒pPICZαA-rhALR使其线性化后电转入酵母菌GS115中，在含博来霉素的YPD平板上筛选出高拷贝阳性转化酵母菌落，以甲醇诱导分泌表达 rhALR。经镍柱亲和层析纯化表达的上清蛋白，再用SDS-PAGE胶电泳和Western Blot鉴定。CCK-8检测获得rhALR对人肝癌细胞HepG2的促增殖活性。利用细胞贴壁分离法体外分离小鼠骨髓间充质干细胞，通过连续传代达到一步步纯化骨髓间充质干细胞的目的，在显微镜下观察细胞形态学变化，利用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞的表面抗原标志物以鉴定细胞的纯度；CCK-8法检测不同浓度ALR（1 -100ug/mL）组与阴性对照组作用于小鼠骨髓间充质干细胞 48h 后对细胞增殖的影响；使用碱性磷酸酶检测试剂盒检测ALR组和经典成骨诱导组诱导7天后碱性磷酸酶活性变化；采用茜素红染色检测ALR组和经典成骨诱导组成骨诱导14天后钙结节形成情况，并利用实时荧光定量PCR法检测ALR组和对照组成骨诱导14天后成骨相关基因 Runx2、OCN、OPN的表达情况，从基因水平探讨ALR对小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。　　结果 重组质粒经酶切和测序鉴定均与预期结果一致。rhALR 被分泌表达于上清，经镍柱亲和层析、SDS-PAGE胶电泳后考马斯亮蓝染色，可见纯化产物为单一分子量约17.5 kD条带。用特异性ALR抗体检测结果显示此单一条带为 ALR。CCK-8 试剂测得 rhALR 对 HepG2细胞的体外促增殖作用呈浓度依赖性增强。细胞贴壁分离法能有效分离纯化得到小鼠骨髓间充质干细胞，体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞生长状态良好，流式检测结果显示培养的细胞表面抗原标志物CD105、CD29、CD44、CD90.2的阳性率达 95%以上，而阴性表面抗原标志 CD34、CD45表达率低于5%，符合小鼠骨髓间充质干细胞一般生物学特性；与对照组相比，浓度为（1、10、100ug/mL）的ALR在48h 时对小鼠骨髓间充质干细胞增殖有促进作用，且呈浓度依耐性（p＜0.01）；成骨诱导 7 天后，碱性磷酸酶的活性升高；成骨诱导 14 天后，产生的钙结节增多且成骨相关基因（Runx2 、OCN、OPN）的表达量增加（p＜0.01）。　　结论 ALR可促进骨髓间充质干细胞的增殖与成骨分化。　　二、甲状旁腺激素对骨折愈合有效性和安全性的荟萃分析　　目的：本文通过纳入近年来全球范围内相关高质量的随机对照试验（RCT）做荟萃分析，旨在探讨PTH对于骨折愈合的有效性和安全性。　　方法：通过互联网对EMBASE、PubMed和Cochrane Library数据库进行了系统的检索，内容为2018年4月26日之前的所有数据。我们纳入了比较PTH治疗组与对照组（安慰剂组或空白对照）对骨折愈合疗效及安全性分析的RCTs，其间我们联系某些研究的主要作者，但没能获得更多的实验数据。我们采用盲法进行数据提取、研究质量评估。本荟萃分析采用随机效应模型得到平均差、标准化平均差（95%置信区间），从而确定优势比。　　结果：共有 8 项随机对照试验符合纳入标准，其中排除了部分不符合要求的实验组，纳入患者数共524例。结局指标显示：PTH治疗组骨折愈合时间、疼痛缓解程度、功能改善情况明显优于对照组，骨折愈合率和主要不良事件(包括头晕、高钙血症、恶心、出汗和头痛)无显著差异。　　结论：我们认为 PTH 治疗在骨折愈合过程中是有效的、安全的。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

一、肝再生增强因子（ALR）对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

前言

1材料

1.1动物、细胞与菌株

1.2主要试剂和仪器

2实验方法

2.1重组表达质粒的扩增

2.2重组质粒电转入酵母菌

2.3目的蛋白表达及条件优化

2.4表达上清蛋白SDS-PAGE及Western Blot分析

2.5上清蛋白纯化

2.6 rhALR活性检测

2.7小鼠间充质干细胞的分离和培养

2.8小鼠间充质干细胞的流式鉴定

2.9小鼠间充质干细胞的体外成骨诱导分化

2.10碱性磷酸酶检测

2.11茜素红染色检测

2.12成骨相关基因的检测

3结果

3.1重组质粒的鉴定

3.2重组酵母菌表达及表达条件优化

3.3表达产物Western Blot鉴定

3.4 rhALR蛋白活性鉴定

3.5小鼠骨髓间充质干细胞的形态学

3.6小鼠 BMSCs的流式鉴定

3.7 rhALR促BMSCs增殖

3.8碱性磷酸酶染色

3.9茜色红染色

3.10成骨相关基因表达情况

4讨论

全文总结

参考文献

二、甲状旁腺激素对骨折愈合有效性和安全性荟萃分析

前言

1方法

1.1检索策略

1.2纳入标准

1.3偏倚风险评估

1.4数据提取

1.5统计分析

1.6证据质量分级

2结果

2.1纳入研究及一般特征

2.2偏倚风险评估

2.3骨折愈合的影像学评估

2.4骨折的疼痛程度

2.5功能恢复结果

2.6不良事件

2.7发表偏倚和证据质量分析

3讨论

全文总结

参考文献

文献综述:间充质干细胞治疗在骨科疾病治疗中的应用

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文