锰矿物驱动的甲烷厌氧氧化菌的富集及甲烷厌氧氧化过程研究

摘要

甲烷厌氧氧化(AOM)是一种重要的生化过程,作为自然界CH4代谢的关键环节,其削减了超过90%的海洋底层所产生CH4和约50%的淡水湿地CH4,使得最终进入大气的 CH4十分有限,因此甲烷厌氧氧化在地球碳循环过程中占有非常重要的地位.研究人员在海洋和淡水系统中都观察到了金属驱动的甲烷厌氧氧化现象,其速率可高达自然栖息地最大产甲烷率的 15%.在早期和现代地球上,金属驱动的甲烷厌氧氧化在生物地球化学循环和地质演化中具有重要作用.锰广泛存在于各种海洋和淡水环境中,但到目前为止,锰矿物驱动的甲烷厌氧氧化的相关功能微生物和作用过程还鲜有人研究.　　本试验通过构建序批式微生物富集反应器,分别以锰矿湿地污泥和自然混合污泥作为接种物,以天然锰粉和人工合成δ-MnO2为电子受体富集锰矿物驱动的甲烷厌氧氧化(Mn-AOM)微生物,并结合 13CH4稳定同位素示踪、高通量测序、荧光绝对定量(qPCR)、荧光原位杂交(FISH)、系统发育分析和RDA相关性分析等手段,分析Mn-AOM长期富集过程中的甲烷厌氧氧化效果,探索主导Mn-AOM的关键作用微生物种群及其介导AOM的作用途径,分析锰矿物种类和污泥接种来源对甲烷厌氧氧化的影响,探讨长期富集过程中AOM速率与功能微生物丰度之间的相关关系,明晰Mn-AOM过程.主要研究结果如下:　　① 经过700多天的富集培养,4个反应器均表现出明显的甲烷厌氧氧化效果.长期富集过程中(T=150d~700d),反应器R1(湿地污泥+天然锰粉组)、R2(混合污泥+天然锰粉组)、R3(湿地污泥+δ-MnO2组)、R4(混合污泥+δ-MnO2组)的平均CH4氧化速率分别为:0.1270 mmol·L-1·d-1、0.1598 mmol·L-1·d-1、0.2118 mmol·L-1·d-1、0.1749 mmol·L-1·d-1.　　② 长期运行过程中 R3(湿地污泥+δ-MnO2组)和 R4(混合污泥+δ-MnO2组)以δ-MnO2为电子受体的甲烷厌氧氧化菌富集效果要高于以天然锰矿粉为电子受体的R1(湿地污泥+天然锰粉组)和R2(混合污泥+天然锰粉组)(p＜0.05).R3和R4的AOM速率更高,说明电子受体 Mn(Ⅳ)的形态可以影响甲烷厌氧氧化菌的富集效果, 并且以δ-MnO2为电子受体的体系 ANME-2d 古菌数量高于以天然锰粉为电子受体的数量.试验发现,接种污泥会显著影响富集培养物的群落结构,两种不同接种污泥的微生物群落结构存在明显差异.　　③ 稳定同位素实验富集培养物中的?13CTIC随着富集时间有明显的升高,证明了以 CH4为唯一电子供体的甲烷厌氧氧化过程.电子守恒实验验证了在锰矿物还原的同时伴随着甲烷氧化过程,并且实验中Mn(Ⅱ)的总产生量和CH4的总减少量之间的比值为3.85±0.25,接近于CH4和Mn(Ⅳ)反应的化学计量学比例4.32±0.36, Mn(Ⅳ)的还原量和 Mn(Ⅱ)的生成量与 CH4的氧化量比值都接近 4:1,符合锰矿物驱动的甲烷厌氧氧化的化学计量学过程,证实了反应器内的甲烷厌氧氧化是以Mn(Ⅳ)作为唯一的电子受体.　　④ 采用高通量测序、qPCR、FISH等分子生物学技术鉴定出了ANME-2d、产甲烷菌与两种锰还原菌(厌氧粘细菌和地杆菌)的种类.富集反应器中发现了ANME-2d、产甲烷菌和锰还原菌和共存的现象.　　⑤ 定量 PCR 得到富集 700 天时 4 个反应器内 ANME-2d 的丰度分别为:4.57×106copies·g-1(dry sludge)、6.90×106copies·g-1(dry sludge)、1.07×107copies·g-1 (dry sludge)和8.85×106copies·g-1(dry sludge).相关性分析表明,甲烷的氧化过程伴随着ANME-2d簇的增长,富集期间AOM速率变化和ANME-2d簇丰度增长之间呈明显的正相关关系,相关系数R2可达0.95.而其他几种主要微生物如产甲烷菌、地杆菌、异化金属还原菌与甲烷厌氧氧化速率之间的关系不明显,阐明了以ANME-2d为主导的Mn(IV)驱动的甲烷厌氧氧化过程.

目录

文中缩写说明

1 绪 论

1.1引言

1.2甲烷厌氧氧化研究历程与研究进展

1.3金属驱动的甲烷厌氧氧化（Metal-AOM）

1.3.1 Metal-AOM的预测及发现

1.3.2 Metal-AOM的微生物类群

1.3.3 Metal-AOM反应机制

1.3.4 Metal-AOM的环境意义

1.3.5 Metal-AOM对金属、硫和磷的地球化学影响

1.4.1研究目的

1.4.2研究内容

1.5研究意义

1.6技术路线

2 实验方法与实验材料

2.1富集实验设计

2.1.1功能微生物富集反应器

2.1.2电子受体

2.1.3接种物

2.1.4液体培养基

2.1.5 富集反应器的运行条件

2.2批次实验设计

2.2.1同位素示踪实验设计

2.2.2电子守恒实验设计

2.3.1富集过程气体测定

2.3.2富集过程常规水质指标测定

2.3.3批次实验中相关指标的测试方法

2.3.4 DNA提取

2.3.5 高通量测序

2.3.6 荧光绝对定量（qPCR）

2.3.7 荧光原位杂交（FISH）

2.3.8 系统发育分析

2.4.1实验主要仪器

2.4.2实验气体及主要试剂

2.4.3实验所用引物与探针

3 锰矿物驱动的的甲烷厌氧氧化菌富集

3.1.1 内源呼吸期实验结果

3.1.2 富集前期实验结果

3.1.3富集中期实验结果

3.1.4富集后期实验结果

3.1.5 各反应器富集不同阶段甲烷厌氧氧化速率结果

3.2.1同位素实验结果

3.2.2电子平衡实验结果

3.3本章小结

4 富集培养物微生物群落结构分析

4.1.1古菌多样性分析

4.1.2细菌多样性分析

4.2.1各富集反应器中ANME-2d古菌绝对定量分析

4.2.2各富集反应器中产甲烷菌绝对定量分析

4.2.3各富集反应器中地杆菌绝对定量分析

4.2.4各富集反应器中厌氧粘细菌绝对定量分析

4.3荧光原位杂交分析

4.3.1 R1反应器（湿地污泥+天然锰粉组）荧光原位杂交分析

4.3.2 R2反应器（混合污泥+天然锰粉组）荧光原位杂交分析

4.3.3 R3反应器（湿地污泥+δ-MnO2组）荧光原位杂交分析

4.3.4 R4反应器（混合污泥+δ-MnO2组）荧光原位杂交分析

4.4 系统发育分析

4.5.1菌群丰度和甲烷厌氧氧化速率之间相关性分析

4.5.2环境因子与功能菌群之间相关性分析

4.6 本章小结

5 结论与展望

5.1主要结论

5.2创新点

5.3建议与展望

参考文献

附录

A 作者在攻读学位期间发表的论文目录

B 学位论文数据集

致谢