敲低PLCε通过抑制AR活性增加去势抵抗性前列腺癌细胞对恩杂鲁胺的敏感性

摘要

目的　　PLCε(Phospholipase Cε)是一种癌基因,在激素敏感性前列腺癌中高表达,Hedgehog/Gli信号通路在前列腺癌(Prostate cancer,PCa)组织中存在过度激活的现象,前期研究结果提示,在PCa中PLCε以及Hedgehog信号通路均参与雄激素受体(Androgen receptor, AR)的调节,但 PLCε、Hedgehog/Gli 在去势抵抗性前列腺癌(Castration-resistant prostate cancer, CRPC)中的作用尚不清楚.本研究的目的是探讨PLCε、Hedgehog/Gli与AR在CRPC中的相互作用关系以及作用机制,以及在CRPC细胞中敲低PLCε是否通过调节AR活性来影响其对恩杂鲁胺的药物敏感性.　　方法:　　1)收集2010年1月至2015年8月重庆医科大学附属第一医院的良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)组织标本30例,前列腺癌(PCa)组织标本64例,以及CRPC石蜡切片和组织标本(共27例).使用免疫组织化学方法(IHC)检测PLCε和Gli-1、Gli-2的蛋白表达水平,统计分析PLCε、Gli-1和Gli-2在BPH、PCa以及CRPC组织中的表达差异及相关性,并分析PLCε在CRPC组织中的表达情况与临床及病理参数之间的关系,进一步分析CRPC患者生存率(overall survival,OS)和无进展生存期(progression-free survival,PFS).　　2)使用LNCaP、22RV1、EN-R三个细胞株,(22RV1、EN-R代表CRPC细胞)Western blot及RT-qPCR方法检测三株细胞中PLCε蛋白及mRNA水平的表达.使用慢病毒载体LV-shPLCε转染LNCaP、22RV1、EN-R细胞以敲低PLCε,用克隆形成实验以及CCK-8实验检测细胞的增殖能力;Transwell实验观察细胞的侵袭能力.并根据CCK-8实验计算各株细胞在不同处理组中恩杂鲁胺的IC50值,从而评估各株细胞对恩杂鲁胺的敏感性.　　3)使用22RV1、EN-R两个细胞株,慢病毒载体LV-shPLCε敲低PLCε,以及单独或联合使用Hedgehog/Gli信号通路抑制剂GANT61处理,Western blot及RT-qPCR方法检测两株细胞中PLCε、Hedgehog信号通路相关分子、AR等蛋白及mRNA水平的表达.　　4)敲低PLCε或/和过表达Gli-1/Gli-2处理EN-R细胞.细胞免疫荧光实验检测AR蛋白的核、浆表达情况差异;Western blot及RT-qPCR分别检测EN-R细胞株中PLCε、Gli-1、Gli-2、AR、PSA、STAT3以及磷酸酸化STAT3的蛋白及mRNA表达水平,并统计分析其表达差异.　　5)4周龄的裸鼠分别于皮下接种2x106个EN-R(cont组)细胞或LV-shPLCεEN-R(LV-shPLCε组)细胞,然后每组小鼠再分成两组,分别予以10mg/kg PBS或恩杂鲁胺喂养,32天后处死小鼠,计算瘤体体积,绘制肿瘤生长曲线.　　结果:　　1)与良性前列腺增生组织相比,PLCε、Gli-1及Gli-2在大多数PCa以及CRPC组织中的表达明显增加,而且PLCε(P=0.0447)、Gli-1 (p=0.0152)在CRPC组织中的表达与其在PCa组织中的表达差异具有统计学意义,而Gli-2在PCa及CRPC组织中的表达中无显著性差异(p=0.0585).在CRPC组织中,PLCε的表达与Gli-1(r=0.586,p=0.01)及Gli-2(r=0.409,p=0.034)的表达均呈正相关.Kaplan-Meier 生存分析显示,在CRPC组织中,PLCε表达阳性的患者(PFS=24个月)与PLCε表达阴性的患者(PFS=28个月)之间的中位无进展生存期具有统计学差异(P=0.025).在PCa组织中,PLCε表达阳性的患者(OS=61个月)与PLCε表达阴性的患者(OS=68个月)之间的总体生存期也具有显著的统计学差异(P=0.027).　　2)PLCε在LNCaP、22RV1、EN-R细胞中均高表达,与LNCaP细胞相比较,它在22RV1及EN-R细胞中的表达具有统计学差异.Gli-1及Gli-2在LNCaP细胞中低表达,但在22RV1及EN-R细胞中均高表达.CCK-8实验结果显示,LV-shPLCε或/和GANT61处理均显著地抑制22RV1、EN-R细胞的活性.克隆形成实验显示LV-shPLCε或/和GANT61能够抑制CRPC细胞的增殖能力.Transwell实验结果显示, LV-shPLCε或/和GANT61抑制CRPC细胞的侵袭能力.CCK-8实验结果显示,LV-shPLCε或/和GANT61增加了CRPC细胞对恩杂鲁胺的敏感性.　　3)在22RV1及EN-R细胞中敲低PLCε抑制了Gli-1/Gli-2以及AR的mRNA和蛋白表达水平,反之抑制Gli-1/Gli-2的表达并不影响PLCε的表达,提示PLCε是Gli-1/Gli-2的上游调节因子.然而,在PLCε敲低后,Smo(经典Hh信号通路中Gli的上游调控基因)没有表现出显著的mRNA和蛋白表达变化.提示PLCε通过非经典的Hh/Gli信号途径影响Gli-1/Gli-2的表达.　　4)敲低PLCε或/和过表达Gli-1/Gli-2处理EN-R细胞,细胞免疫荧光实验结果提示敲低PLCε通过Gli-2/AR信号途径来抑制AR的核转位,Western blot及RT-qPCR结果显示敲低PLCε通过p-STAT3信号途径来影响AR的靶基因PSA的表达.　　5)动物实验结果显示敲低PLCε抑制了去势抵抗性前列腺癌细胞皮下移植瘤的生长并增加了CRPC细胞移植瘤对恩杂鲁胺的药物敏感性.　　结论:　　1.PLCε阳性表达预示CRPC患者较差的临床预后.　　2.抑制PLCε的表达可以抑制CRPC细胞的增殖以及侵袭能力.　　3.PLCε通过非经典的Hh/Gli信号途径以及p-STAT3信号途径调节AR的活性,从而增加了去势抵抗性前列腺癌细胞对恩杂鲁胺的药物敏感性.

目录

英汉缩略语名词对照

前言

参考文献

第一部分 PLCε与Gli-1、Gli-2在良性前列腺增生、前列腺癌与去势抵抗性前列腺癌组织中的蛋白含量表达及相关性分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 PLCε和Gli-1、Gli-2在BPH、PCa和CRPC组织中的表达情况

2.2 PLCε和Gli-1、Gli-2在BPH、PCa和CRPC组织中的表达差异

2.3 PLCε和Gli-1、Gli-2在CRPC组织中的表达相关性分析

2.4 CRPC组织中PLCε的阳性表达提示较差的临床预后

3 讨论

4 小结

参考文献

第二部分 PLCε对CRPC细胞的增殖侵袭能力以及对恩杂鲁胺药物敏感性的影响

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 PLCε、Gli-1、Gli-2以及AR在前列腺癌细胞系LNCaP、22RV1、EN-R中的表达

2.2 LV-shPLCε抑制了CRPC细胞中PLCε的表达，GANT61抑CRPC细胞中Gli-1及Gli-2的表达

2.3 敲低PLCε抑制CRPC细胞的活力

2.4 敲低PLCε抑制CRPC细胞的增殖能力

2.5 敲低PLCε抑制CRPC细胞的侵袭能力

2.6 敲低PLCε增加了CRPC细胞对恩杂鲁胺的药物敏感性

3 讨论

4 小结

参考文献

第三部分 PLCε调节CRPC细胞对恩杂鲁胺的敏感性的机制研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 敲低PLCε通过非经典的Hedgehog信号通路抑制Gli-1及Gli-2的表达

2.2 敲低PLCε通过Gli2/AR途径抑制AR的核转位

2.3 敲低PLCε通过p-STAT3信号途径抑制AR靶基因PSA的表达

3 讨论

4 小结

参考文献

第四部分 敲低PLCε影响CRPC细胞移植瘤对恩杂鲁胺的敏感性

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

全文总结

文献综述:去势抵抗性前列腺癌恩扎鲁胺耐药机制的研究进展

致谢

攻读博士学位期间发表论文