血清尿酸测定试剂盒新配方的建立和评价

摘要

尿酸是体内嘌呤代谢的终产物，呈弱酸性，pka5.8。各种嘌呤氧化后生成的尿酸大部分随尿排出，因溶解度较小，在体内浓度偏高时容易析出结晶而引起疾病，比如痛风性关节炎、继发性高血压、脑梗死、输尿管结石和肾脏疾病等。因此临床检测血清尿酸浓度对实验诊断痛风和肾脏疾病具有重要的参考价值。目前测定尿酸的方法有尿酸酶法、磷钨酸还原法、伏安法、液相色谱法、毛细管电泳法和同位素稀释质谱法等。临床检测血清尿酸主要用尿酸酶-过氧化物酶偶联法。此方法用尿酸酶催化尿酸完全氧化成尿囊素和过氧化氢(H2O2)，H2O2在酶催化下氧化特定生色底物，通过分光光度法测定显色产物，而建立的尿酸分析方法。　　本实验通过考察pH对尿酸酶、辣根过氧化物酶和抗坏血酸氧化酶稳定性的影响，优化了血清尿酸测定试剂盒新配方，并对新双试剂盒进行诊断性能评价。在4℃，来自苛求芽孢杆菌和产阮假丝酵母菌的尿酸酶在pH9.2的50mmol/L硼酸盐缓冲液中半衰期约12个月。在4℃，抗坏血酸氧化酶和辣根过氧化物酶在pH6.5和pH7.0的磷酸盐缓冲液中半衰期相当，但比在≥pH7.4的磷酸盐缓冲液中半衰期长。优化后的尿酸双试剂新配方，试剂A:辣根过氧化物酶＞1.5 U/ml，4-氨基安替比林(4-APP)0.25 mmol/L，抗坏血酸氧化酶＞0.67 U/ml，苯甲酸钠3.5mmol/L，溶解在pH6.5的50mmol/L磷酸盐缓冲液中;试剂B:尿酸酶＞2.0U/ml，2.33 mmol/L的N-乙基-N-（2-羟基-3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)，苯甲酸钠3.5 mmol/L，溶解在pH9.2的50mmol/L硼酸缓冲液中。试剂A和B以4∶1混合使反应混合物的pH值处于显色产物稳定吸收的最佳pH值(73)，因此确保了测定尿酸的灵敏度和显色产物的稳定性。双试剂盒新配方在546 nm测定血液中尿酸的浓度，在尿酸浓度16～1600μmol/L范围内显色产物的吸光度与尿酸浓度的线性关系良好，相关系数r＞0.999。双试剂盒新配方与商业化试剂盒同时检测临床血清样品中尿酸含量时相关性良好，但双试剂盒新配方表现出较强的抗抗坏血酸干扰的能力。这种新配方明显提高了尿酸酶在试剂盒中的稳定性，降低其初始浓度，试剂盒中辣根过氧化物和抗坏血酸氧化酶的稳定性也略有提高，试剂盒保质期延长，成本降低，方法简单、可靠，可用于临床血清尿酸检测。　　为了验证尿酸试剂盒新配方测定血清尿酸的可靠性，本实验建立了液相色谱-同位素稀释质谱法(LC-ID/MS)测定血清尿酸含量作为参考方法。LC-ID/MS对同一批血清样品进行测定，测得尿酸结果与尿酸酶-过氧化物酶偶联法基本一致。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

第一部分 血清尿酸测定试剂盒新配方的建立和评价

1 仪器与材料

1．1 主要仪器设备

1．2 主要试剂

1．3 临床样品

1．4 试剂配制

2 实验方法

2．1 尿酸酶的制备

2．2 酶的活性测定

2．3 pH值对酶稳定性的影响

2．4 血清尿酸测定试剂盒新配方优化

2．5 双试剂盒测定血清尿酸试验及评价

3 结果与讨论

3．1 pH值对双试剂盒酶稳定性的影响

3．2 血清尿酸测定双试剂盒新配方

3．3 自制新试剂盒诊断性能评价

4 结论

第二部分 液相色谱-同位素稀释质谱法测定血清尿酸含量

1 仪器与材料

1．1 主要仪器与设备

1．2 主要试剂

1．3 标准溶液的配制

1．4 内标储备溶液的混合

1．5 样品的制备

2 实验方法

2．1 色谱和质谱条件

2．2 色谱峰的确定

3 结果与讨论

3．1 离子对的确定

3．2 溶剂优化

3．3 LC-ID／MS方法验证

3．4 LC-ID／MS／MS方法验证

3．5 样品含量测定

4 结论

全文总结

参考文献

文献综述 血清尿酸生化诊断试剂的临床研究

致谢

攻读硕士期间发表的论文