运动通过重构肠道菌群对高脂诱导C57BL/6小鼠非酒精性脂肪性肝病的防治作用研究

摘要

目的:　　非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种无过量饮酒史，由各种原因引起的，以肝细胞脂肪变性和脂质蓄积为主要特征的临床病理综合征，已成为全球重要的健康问题之一，与肝硬化和肝癌的发生发展密切相关。在疾病早期，积极探索安全有效的干预措施十分必要，可显著提高患者的生活质量并减轻国家的医疗负担。运动是世界公认的最方便、安全、经济、有效的防治NAFLD的措施，是早、中期NAFLD转归的理想方案。尽管已有多个人群研究表明适度的耐力运动可以有效管理NAFLD，动物实验也揭示运动可通过抑制巨噬细胞浸润减少肝脏炎症、损伤和纤维化，但具体机制仍未明确。运动对NAFLD的影响，部分可能是直接作用，更多的可能是通过体内不同组织之间的相互作用而实现。肠道在系统炎症和代谢综合征的发生、发展中处于中枢环节，肠道黏膜屏障功能与NAFLD关系密切，在营养素吸收和防止有害大分子进入人体中发挥重要的生理、物理、化学和免疫学作用。肠道屏障功能的损伤伴随肠源性抗原(如LPS)泄漏的增加可能导致内脏脂质沉积。有研究表明NAFLD患者肠道菌群失调、小肠黏膜通透性增加进而影响了肝脏脂肪分布。　　肠道菌群是人体的一个不能被忽视的代谢器官，在NAFLD的发生发展中扮演重要角色。肝脏接受到肠道通过门静脉输送的70％的血液，所以是肠菌抗原的第一道防线，也是肠源性毒素和代谢产物最广泛的暴露器官之一。肠道菌群及其代谢产物可直接或间接的影响宿主的炎症状态进而改变机体的代谢平衡。结肠细菌发酵最主要的终产物有乙酸、丙酸和丁酸。乙酸进入外周循环被外周组织代谢。被吸收后的乙酸增加了胆固醇的生成，但是丙酸却抑制胆固醇的生成。丙酸主要被肝脏吸收，丙酸对血清脂质的作用与丙酸和乙酸的比例有关，此比值的降低可能减少血清脂质进而降低心血管疾病的发生风险。丁酸是结肠细胞首选的能量来源，可调控细胞凋亡、分化和增殖。增加的肠渗透性和受到破坏的肠黏膜屏障在肠道菌群及其产物从肠内向肠外位移中起重要作用。　　本研究利用高脂饲料喂食C57BL/6小鼠建立NAFLD动物模型，同时以小鼠跑步机运动训练作为干预方式，通过观察运动对高脂喂食小鼠的肠黏膜屏障功能、肠道菌群及其代谢产物—短链脂肪酸和肝脏脂质蓄积及炎症的影响，从肠道菌群及肠黏膜屏障功能的角度探讨运动减轻高脂喂食小鼠肝脏脂质蓄积和炎症的可能机制，为运动防治NAFLD的研究提供一个新的思路，有重要的临床意义。　　方法:　　C57BL/6小鼠分为3组:正常组、高脂组和高脂运动组。正常组喂食普通饲料，高脂组和高脂运动组利用高脂饲料喂食建立NAFLD动物模型，同时高脂运动组以小鼠跑步机运动训练作为干预方式。8周后检测各组小鼠血浆和肝脏的一般生化及炎症指标，对肝组织进行HE染色、油红O染色，用透射电镜观察结肠组织结构，对小鼠肠道菌群进行结构和聚类分析，测定粪便中短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸)的含量。　　结果:　　与ND组相比，HFD组小鼠血浆T-CHO、TG、LDL-C，肝组织TG、T-CHO，FBG，FINS，LPS的含量和TLR4、TNF-α、IL-6的表达水平均显著增加(P＜0.05)，结肠组织Occludin蛋白表达水平显著降低(P＜0.05);与HFD组相比，HFD+EX组小鼠血浆TG、LPS、FBG、肝组织TG、T-CHO的含量和TLR4、TNF-α和IL-6的表达水平均显著降低(P＜0.05)，结肠组织Occludin蛋白表达水平显著增加(P＜0.05)。各组小鼠粪便中主要短链脂肪酸的含量测定结果显示，与ND组小鼠相比，HFD组和HFD-EX组小鼠粪便中乙酸、丙酸、丁酸含量均显著降低，且差异有统计学意义(P＜0.05)。对各组小鼠肠道菌群DGGE图谱分析显示，尽管3组小鼠肠道菌群结构明显不同，但是HFD-EX组和ND组小鼠DGGE图谱更为相似。qPCR对各组小鼠粪便中变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)细菌的mRNA相对定量结果显示，与ND组相比，HFD组小鼠粪便中厚壁菌门(Firmicutes)细菌显著减少(P＜0.05);与HFD组小鼠相比，HFD+EX组小鼠粪便中放线菌门(Actinobacteria)细菌显著增加(P＜0.05)。各组小鼠肝脏病理切片显示，HFD组较ND组小鼠脂肪空泡增多，脂滴增大;HFD+EX组较HFD组小鼠脂肪空泡减少，脂滴变小。透射电镜结果显示，与ND组相比，HFD组小鼠肠上皮黏膜微绒毛数量较少、排列稀疏且紧密连接结构宽度增大，HFD+EX组小鼠较HFD组肠上皮黏膜微绒毛数量增多且紧密连接结构宽度减小。　　结论:　　运动可能通过重构高脂喂食小鼠的肠道菌群保护肠黏膜屏障功能，从而减轻肝脏脂质蓄积和炎症状态达到防治酒精性脂肪性肝病的发生发展的目的。

目录

声明

缩略语表

摘要

1．前言

2．研究材料与方法

2．1 实验对象

2．2 实验设备和试剂

2．3 分组和训练

2．4 取材方式

2．5 指标测算方法

2．6 数据统计学处理方法

3．实验结果

3．1 运动对小鼠每周体重的影响

3．2 运动对小鼠肝重及肝指数的影响

3．3 运动对小鼠体脂的影响

3．4 运动对小鼠血浆TC、TG、HDL-C和LDL-C含量的影响

3．5 运动对小鼠空腹血糖、空腹胰岛素含量及HOMA-IR的影响

3．6 运动对小鼠肝组织T-CHO、TG含量的影响

3．7 运动对小鼠肝脏组织病理切片的影响

3．8 运动对小鼠肝脏组织中TLR4、TNF-α和IL-6表达水平的影响

3．9 运动对小鼠结肠黏膜屏障功能的影响

3．10 运动对小鼠血浆中LPS含量的影响

3．11 运动对小鼠粪便中主要短链脂肪酸含量的影响

3．12 运动对小鼠肠道菌群结构的影响

4．分析与讨论

5．结论与建议

参考文献

文献综述 运动、肠道菌群和肠黏膜屏障功能与非酒精性脂肪性肝病相互关系的研究进展

在读期间发表的学术论文

致谢