T3SS效应蛋白YopJ与YopT参与鼠疫耶尔森菌致病性的分子机制研究

摘要

鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)是历史上导致死亡人数最多的传染病菌，它不能直接感染人类，而是通过跳蚤等动物产生间接感染。通常情况下，进入人体的病原菌的病原相关分子模式(pathogen associated molecule patterns，PAMPs)会被宿主的模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）所识别而被免疫细胞吞噬或抑制，不能建立持续的感染。而鼠疫耶尔森菌存在某些免疫逃逸机制可以逃避免疫系统的监控，例如，鼠疫耶尔森菌可以通过Ⅲ型分泌系统(TypeⅢSecretion System，T3SS)将毒性质粒(virulence plasmid, pYV)编码的效应蛋白（Yersinia outer proteins，Yops）注入宿主的巨噬细胞，继而下调巨噬细胞的固有免疫信号转导并抑制相关细胞因子的产生，最后导致宿主细胞的死亡，释放出病原菌。释放后的鼠疫菌进一步通过淋巴进入血液和全身器官，形成高致死性的败血症鼠疫和肺鼠疫。
　　Yops家族成员包括YopE、YopM、YopH、YpkA（在小肠结肠炎耶尔森菌中为YpkO）、YopJ（在小肠结肠炎耶尔森菌中为YopP）、YopT等。其中，YopJ在鼠疫耶尔森菌感染宿主过程中尤为关键，因为它被认为是唯一一个可以抑制宿主固有免疫的效应蛋白，可以通过去泛素化TRAF2、TRAF6和IKK下调NF-κB信号通路，对鼠疫耶尔森菌在宿主细胞内建立持续感染具有十分重要的意义。我们的研究表明，YopJ也可以通过去泛素化STING抑制宿主Ⅰ型干扰素信号通路的激活。除此之外，我们的初步研究表明，YopT很可能也通过其特有的去泛素化酶活性抑制RLRs信号通路的激活:
　　1、YopJ通过去泛素化STING抑制Ⅰ型干扰素信号通路的激活:
　　通过GST-pull down实验发现YopJ能够与STING发生相互作用;通过荧光素酶报道基因实验，发现YopJ以剂量依赖的方式抑制干扰素报告基因的激活。
　　2、YopJ抑制Ⅰ型干扰素信号通路的分子机制研究:
　　通过免疫印迹实验，发现YopJ可以降低STING的稳定性;通过体内泛素化实验，发现YopJ降低STING的K63位泛素化水平;通过荧光素酶报告基因实验，发现STING的K370位是其重要的活性位点;通过点突变的方法将YopJ半胱氨酸蛋白酶活性位点172位半胱氨酸突变为丙氨酸，发现突变体丧失了对STING K63位的去泛素化修饰作用;通过免疫印迹实验，发现该突变体无法诱导STING的稳定性下调;通过荧光素酶报道基因实验，发现YopJ突变体无法抑制干扰素报道基因的激活;通过鼠疫耶尔森菌野生菌以及YopJ敲除菌感染实验，发现YopJ敲除菌丧失了对STING和TBK1相互作用的抑制。
　　3、YopT可能通过其去泛素化酶活性抑制RLRs信号通路的激活:
　　通过免疫印迹实验，发现YopT可以降低RIGI、MAVS和TBK1蛋白的稳定性;通过体内泛素化实验，发现YopT可以降低RLRs信号通路中RIG-Ⅰ的泛素化水平;通过比对YopT的保守氨基酸基序，发现YopT很有可能是一个去泛素化酶，通过点突变的方法将YopT半胱氨酸蛋白酶活性位点139位半胱氨酸突变为精氨酸，利用免疫印迹实验，发现该突变体不能降低RIG-Ⅰ的稳定性;通过荧光素酶报告基因实验发现YopT突变体不能抑制RLRs信号通路的激活。
　　综上所述，本研究发现YopJ可以与STING发生相互作用，并通过其去泛素化酶活性移除STING K63位泛素化修饰，进而降低其稳定性，最终抑制Ⅰ型干扰素信号通路的激活;YopT通过潜在的去泛素化酶活性降低RLRs通路中重要蛋白的稳定性以及泛素化修饰水平，最终抑制Ⅰ型干扰素信号通路的激活。以上研究为进一步探讨T3SS效应蛋白在鼠疫耶尔森菌致病过程中的重要作用奠定了良好的基础。

目录

声明

缩略词表

摘要

引言

1 鼠疫耶尔森菌

1．1 鼠疫的危害

1．2 鼠疫耶尔森菌的Ⅲ型分泌系统

1．3 鼠疫耶尔森菌效应蛋白

2 固有免疫系统

2．1 固有免疫系统的组成

2．2 固有免疫细胞的模式识别受体

3 蛋白的泛素化及去泛素化调节

3．1 泛素化作用

3．2 去泛素化作用

4 YopJ、YopT参与鼠疫耶尔森菌致病性的现有分子机制

4．1 YopJ通过乙酰化酶和去泛素化酶活性抑制多种信号通路

4．2 YopT破坏宿主细胞肌动蛋白纤维的形成

材料与方法

1 材料

1．1 细胞株、菌株及质粒

1．2 培养基

1．3 抗体及工具酶

1．4 试剂与试剂盒

1．5 引物

1．6 仪器和器材

2 方法

2．1 细胞的培养、转染、冻存和复苏

2．2 引物的处理

2．3 质粒的构建、转化及提取

2．4 细菌基因组DNA的提取

2．5 琼脂糖凝胶电泳及回收

2．6 GST-pull down

2．7 蛋白质的免疫印迹实验

2．8 荧光素酶报告基因实验

2．9 体内泛素化实验

2．10 Duolink蛋白临位连接检测蛋白相互作用

结果

1 YopJ通过去泛素化STING抑制Ⅰ型干扰素信号通路

1．1 YopJ抑制宿主细胞的Ⅰ型干扰素信号通路

1．2 YopJ与STING能够发生特异相互作用

1．3 YopJ通过介导STING发生K63-去泛素化从而影响其稳定性

1．4 YopJ通过其半胱氨酸蛋白酶活性对使STING发生去泛素化作用

2 YopT通过去泛素化RIG-Ⅰ抑制RLRs信号通路

2．1 YopT降低RLRs信号通路中RIG-Ⅰ、MAVS、TBK1蛋白的稳定性

2．2 YopT可能是一种去泛素化酶并通过其139位半胱氨酸发挥其生理活性

讨论

结论

参考文献

致谢

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