酿酒酵母转录延伸因子Paf1复合物亚基Rtf1中HMD及Plus3结构域及布氏锥虫未知功能蛋白PDZ结构域结构的初步研究

摘要

蛋白质是生命体的重要组成成分，是生命活动最主要的实施者。蛋白质的功能大多通过与配体如生物大分子的相互作用实现，某些结构域在其中扮演关键角色。研究这些结构域的结构对于阐明其作用机制及进一步揭示全蛋白的功能机制是必不可少的。在本课题中，我们选取了几个参与重要蛋白与配体相互作用的结构域，即酿酒酵母的Rtf1-Plus3、Rtf1-HMD及布氏锥虫中一个未知功能蛋白的PDZ结构域，对其结构进行了初步研究，以期解析高分辨结构，为揭示其作用机制和在全蛋白功能中扮演的角色打下基础。
　　(Ⅰ) Rtf1是转录延伸因子Paf1C中的重要组成部分，通过自身的几个独立的功能结构域经由不同的途径影响转录过程。目前Rtf1的具体功能机制尚不明确。本课题中我们重组克隆、表达和纯化了酿酒酵母Rtf1的两个主要参与配体相互作用的结构域Plus3和HMD，并用圆二色谱(CD)和核磁共振(NMR)等对其结构进行了初步研究。我们已基本确定了异源重组制备该两个结构域并对其进行多维NMR研究的合适的实验条件，为进一步解析其三维结构和揭示其功能机制打下了基础。
　　(Ⅱ) PDZ结构域是介导蛋白与蛋白相互作用的重要结构域之一，能够识别靶蛋白C-末端的序列。PDZ结构域能够参与多样性的生物过程如:胞内运输、离子通道以及信号转导等。利用生物信息学的方法，我们在布氏锥虫基因组数据库中发现几个含PDZ结构域的蛋白。在本课题中，我们重组克隆、表达和纯化了这几个PDZ结构域，并对其中一个通过NMR方法对其进行了初步结构研究，以期为进一步认识其功能机制作出贡献。该PDZ结构域的主链和部分侧链化学位移的认证已完成，CSI二级结构分析显示其由8个β折叠片和一个α螺旋组成，与经典的PDZ结构域的结构组成有一定的差异。布氏锥虫属于低等的真核生物，其PDZ结构域结构的解析，一方面可对其相关生命活动机制的阐明打下基础，另一方面可为揭示PDZ结构域的进化提供线索。

目录

声明

摘要

第一章 研究背景介绍

1．Paf1复合物在转录中的作用

1．1 Paf1复合物发现过程

1．2 Paf1C在转录过程中的作用

1．3 Rtf1亚基的功能

1．4 课题目的和意义

第二章 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 仪器设备

2．1．2 药品试剂

2．2 酿酒酵母Rtf1蛋白结构域的克隆

2．2．1 酿酒酵母Rtf1蛋白HMD和Plus3结构域基因的引物设计及PCR扩增

2．2．2 重组质粒的构建

2．3 重组酿酒酵母Rtf1蛋白HMD和Plus3结构域的表达与纯化

2．3．1 重组ScRtf1-HMD和ScRtf1-Plus3结构域的表达

2．3．2 重组ScRtf1-HMD和ScRtf1-Plus3结构域的纯化

2．3．3 蛋白的透析与浓缩

2．4 圆二色谱(CD)实验

2．5 NMR实验

2．5．1 样品的制备

2．5．2 数据的收集及处理

2．5．3 化学位移微扰实验

第三章 结果与讨论

3．1 序列分析

3．2 ScRtf1-Plus3和ScRtf1-HMD的基因克隆

3．3 重组ScRtf1-Plus3和ScRtf1-HMD的表达和纯化

3．4 ScRtf1-Plus3和ScRtf1-HMD的1H一维核磁共振分析

3．5 ScRtf1-HMD的圆二色谱分析

3．6 ScRtf1-Plus3和ScRtf1-HMD的二维核磁共振检测

3．7 ScRtf1-Plus3化学位移微扰实验

第四章 结论和展望

参考文献

第五章 前言

5．1 PDZ结构域的特点

5．1．1 PDZ结构域单体结构

5．1．2 PDZ结构域的二聚化

5．1．3 串联PDZ结构域

5．2 PDZ结构域与配体的结合

5．2．1 PDZ结构域对蛋白C端的识别

5．2．2 PDZ结构域对蛋白内部序列的识别

5．2．3 PDZ结构域与磷脂的相互作用

5．3 PDZ结构域的功能

5．4 课题目的和意义

第六章 实验方法与步骤

6．1 布氏锥虫未知功能蛋PDZ结构域的氨基酸序列

6．2 重组质粒的构建

6．3 重组蛋白的表达纯化

6．3．1 重组TbPDZ结构域的表达

6．3．2 重组TbPDZ结构域的纯化

6．4 蛋白质分子量的测定

6．5 蛋白的透析、浓缩及稳定性测定

6．6 核磁共振测定蛋白结构

6．6．1 蛋白质15N标记和15N、13C双标记样品的制备

6．6．2 NMR实验记录的谱图

6．6．3 数据处理及分析

6．6．4 主链的认证

6．6．5 化学位移编辑(CSI)

第七章 实验结果与讨论

7．1 序列分析

7．2 布氏锥虫PDZ结构域的重组克隆

7．3 重组TbPDZ结构域的表达和纯化

7．4 重组TbPDZ结构域二维核磁共振检测

7．5 重组TbPDZ结构域的主链认证

7．6 TbPDZ结构域二级结构的CSI分析

第八章 结论与展望

参考文献

发表论文

致谢