雄烯二酮产生菌的诱变选育及发酵条件优化的研究

摘要

雄烯二酮(androstenedione)是甾体激素类原料药生产中不可替代的重要中间体，对机体起着非常重要的调节作用，目前主要通过微生物选择性降解植物甾醇侧链所得。微生物转化法制备雄烯二酮具有产品纯度高、不受原材料限制、步骤简单、易于大规模生产等优点，但是也普遍存在菌种转化能力低，底物植物甾醇在水相中溶解度低等缺点。　　 本文对雄烯二酮产生菌的诱变选育、检测方法、发酵工艺优化、产物的分离纯化进行了研究探索并对产物进行了结构确证，主要完成了以下几个方面的工作。　　 1.建立了气相色谱内标法测定转化产物摩尔产率的方法，选择与产物性质相似的胆固醇作为内标物，准确度高，克服了外标法测量结果误差较大的难题。　　 2.对出发菌株Mycobacterium sp.先后进行亚硝基胍(NTG)诱变和N+注入诱变，确定了最佳NTG诱变浓度为0.6mg/mL，N+最佳注入剂量为60×1011ions/cm2。经筛选得到一株高产突变株Mycobacterium sp.N-2，当植物甾醇添加量为0.2％时，产率最高达到86.52％，比原始菌株提高了约37.8％。连续传代7次，生产稳定性良好。　　 3.以菌株Mycobacterium sp.N-2为出发菌株，对其进行NTG诱变和基于生长压力下的自然选育。即经NTG诱变后，不断提高筛选培养基中植物甾醇的量，来逐渐增大菌株的生长压力，经筛选选育出一株耐受性较好的突变株Mycobacterium sp.N-3，在植物甾醇添加量为1％时，产物的摩尔产率能达到61.4％，比出发菌株提高了近27.7％，且传代7次，生产稳定性良好。　　 4.通过单因素实验对菌株Mycobacterium sp.N-3的发酵条件进行优化，确定了其最佳培养条件为:油水相比例为10∶90，种龄为60h，接种量为12％，温度为30～32℃，培养基初始pH为7.5～8.0，摇床转速为260r/min，转化时间为192h，进一步提高了转化产率。　　 5.对产品粗提物利用硅胶柱层析和结晶方法进行分离纯化，将得到的纯度在97％以上的纯化物利用IR、1H-NMR、13C-NMR、ORD实验对其结构进行确证，将实验结果与文献进行比对，确定产物为雄烯二酮。

目录

声明

摘要

致谢

第一章 绪论

1．1 甾体化合物的概述

1．1．1 甾体化合物的结构

1．1．2 甾体激素类药物的分类与功能

1．1．3 雄烯二酮简介

1．2 雄烯二酮的制备方法

1．2．1 传统制备方法

1．2．2 微生物转化法

1．2．3 雄烯二酮的产生菌

1．2．4 微生物转化法生产雄烯二酮的研究进展

1．3 本课题的研究意义与研究内容

1．3．1 研究意义

1．3．2 研究内容与思路

第二章 高产菌株的诱变育种及筛选

2．1 引言

2．2 实验材料与方法

2．2．1 菌种

2．2．2 培养基

2．2．3 主要试剂及仪器

2．2．4 生长曲线的测定

2．2．5 诱变方法

2．2．6 高产突变菌株的筛选

2．2．7 稳定性实验

2．2．8 分析方法

2．3 结果与分析

2．3．1 生长曲线的测定

2．3．2 NTG诱变效果

2．3．3 N+注入诱变效果

2．3．4 高产菌株遗传稳定性

2．3．5 诱变效果

2．4 本章小结

第三章 高底物耐受性菌株的筛选

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 菌株来源

3．2．2 培养基

3．2．3 主要试剂和仪器

3．3 实验方法

3．3．1 诱变方法

3．3．2 高底物耐受性菌株的筛选方法

3．3．3 检测方法

3．3．4 稳定性实验

3．4 结果与分析

3．4．1 致死率曲线

3．4．2 固体平板筛选结果

3．4．3 稳定性实验

3．5 本章小结

第四章 突变株Mycobacterium sp．N-3的发酵条件优化

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 菌株来源

4．2．2 培养基

4．2．3 主要试剂和仪器

4．3 实验方法

4．3．1 油水相比例对发酵过程的影响

4．3．2 种龄对发酵过程的影响

4．3．3 接种量对发酵过程的影响

4．3．4 温度对发酵过程的影响

4．3．5 初始pH对发酵过程的影响

4．3．6 摇床转速对发酵过程的影响

4．3．7 发酵时间对发酵过程的影响

4．3．8 综合验证实验

4．4 结果与分析

4．4．1 油水相比例对发酵过程的影响

4．4．2 种龄对发酵过程的影响

4．4．3 接种量对发酵过程的影响

4．4．4 温度对发酵过程的影响

4．4．5 初始pH对发酵过程的影响

4．4．6 摇床转速对发酵过程的影响

4．4．7 发酵时间对发酵过程的影响

4．4．8 综合验证实验

4．5 本章小结

第五章 产物的分离纯化及结构确证

5．1 引言

5．2 实验材料

5．2．1 发酵液

5．2．2 主要试剂和仪器

5．3 实验方法

5．3．1 粗产物的获取

5．3．2 硅胶柱层析

5．3．3 结晶实验

5．3．4 纯度检测

5．3．5 产物结构确证

5．4 结果与分析

5．4．1 硅胶柱层析结果

5．4．2 结构确证结果

5．5 本章小结

第六章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文