确炎舒松对大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

摘要

目的:从SD雌性大鼠骨髓中分离培养骨髓间充质干细胞，并研究不同浓度确炎舒松对体外培养的骨髓间充质干细胞各种生物学特性的影响。
　　 方法:
　　 1.应用全骨髓贴壁法分离培养4周龄雌性SD大鼠骨髓间充质干细胞并鉴定。
　　 2.以不同药物浓度(a:1×10-4mol/L，b:5×10-5mol/L，c:1×10-5mol/L，d:1×10-6mol/L，e:1×10-7mol/L，f:0 mol/L)干预培养，显微镜观察细胞形态变化。
　　 3.以不同药物浓度(abcdef)分别加入接种有BMSCs的96孔板中培养，另设一组只加培养基及相应的DMSO，每种浓度设6个复孔，24小时及48小时测定3孔对应吸光度值，分析实验组与对照组增殖情况。
　　 4.以不同浓度确炎舒松(abcdef)分别加入接种细胞后的六孔板中培养48小时， Annexin V-FITC法检测细胞凋亡情况，并记录数据。
　　 5.将BMSCs以适当浓度接种于若干六孔板中，()A组加入地塞米松(10-8M/L)+抗坏血酸(50ug/ml)+β磷酸甘油(10mmol/L)，()B组加入确炎舒松（10-6mol/L）+抗坏血酸(50ug/ml)+β磷酸甘油(10mmol/L)，() C组确炎舒松(10-6mol/L)，() D组加入抗坏血酸50ug/ml+β磷酸甘油10mmol/L，()E组不加任何药物。
　　 每三天换液同时加入各自药物培养21天，分别提取总RNA，应用RT-PCR扩增OCN及β-actin，并进行电泳，采取图像进行应用quantity one软件进行灰度分析。
　　 6.将BMSCs以适当浓度接种于若干六孔板中，分为ABCDE（同上）五组，每三天换液同时加入各自药物培养21天后进行茜素红染色，观察染色结果并拍照。
　　 结果:
　　 1.通过流式表面标记物的鉴定及分化能力的检测表明此次试验成功培养出大鼠骨髓间充值干细胞。
　　 2.与对照组相比，abcd组各组细胞数量减少，形态改变，而e组的数量及形态未见明显不同。
　　 3.各实验组与对照组进行Dunnett-t检验，除E组（培养48小时）组外，余P值均＜0.01，有统计学意义。
　　 4.流式细胞仪凋亡检测结果经统计学分析，Dunnett-t检验，除E组（10-7mol/L）外(P=1)，其余各组与对照组相比都有统计学意义。
　　 5.电泳结果应用quantity one软件进行灰度分析（等高线定量法），结果与对照组（E组）相比， A、B组OCN表达变化与E组相比经统计学分析有统计学意义，而C、D组无统计学意义。A、B组BMP-2表达变化与对照组相比有统计学意义，C、D两组BMP-2变化与对照组相比无统计学意义。
　　 6.ABC三孔茜素红染色阳性，DE两组茜素红染色为阴性。
　　 结论:
　　 1.本次实验通过全骨髓贴壁法成功分离培养出骨髓间充质干细胞。
　　 2.本次实验10-6-10-4mol/L确炎舒松干预大鼠骨髓间充质干细胞后，其形态发生改变，对细胞生长具有抑制作用。
　　 3.本次实验10-6-10-4mol/L确炎舒松组可引起大鼠骨髓间充质干细胞凋亡增加，提示我们局部注射时应控制浓度，减少副作用的产生。
　　 4.本次试验10-6mol/L确炎舒松与地塞米松(10-8mol/L)一样，可促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化。

目录

英文简写说明

摘要

前言

材料与方法

一、主要实验材料

二、实验方法

结果

1、鉴定结果

2、确炎舒松干预后镜下观察结果

3、MTS检测确炎舒松对BMSCs增殖抑制情况

4、流式细胞仪对药物干预后BMSCs凋亡率的检测

5、成骨相关基因检测

6、确炎舒松对BMSCs成骨能力的影响

分析与讨论

小结

参考文献

附录

致谢

综述 糖皮质激素抑制成骨的机制研究进展

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