关于构建靶向前列腺特异性膜抗原(PSMA)的人源化嵌合抗原受体(CAR)基因修饰T细胞的基础研究

摘要

目的：设计和构建第三代靶向前列腺特异性膜抗原（PSMA）的人源化嵌合抗原受体（CAR）基因，制备慢病毒原液感染Jurkat和Molt-4细胞以建立人源化PSMA-CAR T细胞体系及初步鉴定其CAR基因表达和细胞杀伤功能。
　　方法：（1）参考Carl H.June等学者的CD19特异性CAR结构设计，查阅NCBI、PDB及IMGT数据库，设计构建第三代靶向人前列腺癌PSMA抗原的人源化嵌合抗原受体。CAR受体的胞外识别结构域为人源化 PSMA单克隆抗体的单链可变区（svFv），跨膜结构域为 CD8α的铰链区和跨膜区，胞内信号结构域为 TCR受体的CD3ζ链及CD28、4-1BB双共刺激分子信号域，整理并合成全长碱基序列，构建重组CAR基因的慢病毒载体及进行初步鉴定；（2）利用磷酸钙法包装与制备慢病毒，离心法感染Jurkat和Molt-4细胞进行CAR基因修饰，通过流式细胞术检测感染效率，并找出合适的慢病毒感染方法，建立人源化PSMA-CAR T细胞体系；（3）利用real-time PCR和protein-L间接标记法检测CAR基因在T细胞体系的RNA水平及细胞表面表达情况；（4）通过乳酸脱氢酶（LDH）释放法初步检测人源化PSMA-CAR T细胞的杀伤活性。
　　结果：（1）成功合成 CAR基因全长碱基序列，重组 CAR基因的慢病毒载体通过凝胶电泳法鉴定；（2）磷酸钙法包装制备的慢病毒原液对 Jurkat和 Molt-4细胞具有较高的感染效率，单次感染效率可达30％左右，24h后重复感染效率可达50%以上；（3）经特定CAR基因修饰前后的Jurkat和Molt-4细胞的CAR基因RNA水平及细胞表面表达情况有明显差异；（4）LDH释放法显示特定 CAR基因修饰 Molt-4细胞对靶细胞具有一定程度地杀伤活性，而特定CAR基因修饰的Jurkat细胞对靶细胞无法产生杀伤活性。
　　结论：
　　1.慢病毒对Jurka和Molt-4细胞具有较高的感染效率，磷酸钙法制备的慢病毒原液能够用于T细胞株的基因转导；
　　2.本课题中设计构建的人源化 PSMA-CAR基因能够在 T细胞内及表面成功表达；
　　3.人源化PSMA-CAR基因修饰的Molt-4细胞与Jurkat细胞相比，对靶细胞显示出杀伤效应，初步鉴定了人源化PSMA-CAR基因的成功构建，Molt-4细胞能够模拟原代T淋巴细胞的部分杀伤效应功能，可作为工具T细胞用于CAR T细胞技术的部分基础研究。

目录

声明

研究背景

参考文献

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

实验结果

1.设计合成全长CAR基因和构建重组慢病毒载体及其初步鉴定

2.磷酸钙共转染法包装与制备慢病毒

3.慢病毒感染Jurkat和Molt-4细胞效率

4.real-time PCR检测特定CAR在特定基因修饰后Jurkat和Molt-4细胞中的RNA水平表达

5.流式检测CAR在特定基因修饰后Jurkat和Molt-4细胞表面的表达

6.LDH释放法检测CAR T细胞系对靶细胞的杀伤能力

讨论

参考文献

综述:前列腺癌免疫治疗研究进展

缩略词表

致谢