一个与端粒结合蛋白TRF1相互作用的新蛋白：端粒相关中心体蛋白（TACP1）的鉴定及其生物学功能研究

摘要

端粒是真核细胞染色体末端由DNA重复序列和多种结合蛋白组成的特殊保护性结构。染色体复制存在“末端复制问题”，即随着细胞分裂端粒逐渐缩短，当端粒缩短至一定长度时，细胞失去分裂增殖能力而衰老随后凋亡。端粒异常将导致染色体不稳定，而染色体的不稳定性与细胞衰老和肿瘤密切相关。端粒酶是一种具有逆转录活性的核糖核蛋白酶复合物，端粒酶以自身RNA模板合成端粒重复序列添加于染色体末端以补偿因细胞分裂而缩短的端粒DNA序列。端粒酶是细胞维持端粒长度的最主要途径。正常人成体细胞不表达端粒酶活性，而85％以上肿瘤细胞和永生化细胞端粒酶活性明显增高，提示端粒酶在细胞永生化和肿瘤发生发展中起着重要作用。 许多证据显示端粒长度和结构的维持及端粒酶活性受到一组端粒结合蛋白的调控。目前至少发现三组端粒结合蛋白：端粒双链DNA结合蛋白与相关蛋白、端粒单链DNA结合蛋白与相关蛋白及某些参与DNA损伤修复且也定位在端粒上的蛋白质。TRF1是以端粒序列[TTAGGG]27为探针用离子交换与亲和层析法分离纯化获得的第一个人端粒双链DNA结合蛋白。TRF1以同源二聚体形式与端粒双链DNA结合，促使端粒末端环状三级结构T-loop的形成，保护端粒末端。TRF1是端粒长度负调控因子，过量表达TRF1可抑制端粒酶活性并引起端粒缩短，而大量表达其功能缺失突变体则使端粒延长。TRF1可与Tin2、Tankyrase、PinX1、Pot1等其它端粒结合蛋白相互作用。Tankyrase催化TRF1使其多聚核糖腺苷化并从端粒部位解离暴露端粒酶结合位点，使端粒酶与端粒结合而发挥延长端粒作用。TRF1和Tankyrase在细胞有丝分裂期可定位于中心体，而且TRF1过量表达将导致细胞进入有丝分裂期，提示TRF1和Tanryrase还参与了细胞有丝分裂的调控。 中心体是高等真核生物细胞的主要微管组织中心。中心体在细胞有丝分裂过程中有着至关重要的作用。其与双极纺锤体的形成，纺锤体的定向和胞质分裂直接相关。中心体异常将损害细胞分裂的忠实性并导致染色体不稳定。酵母的中心体功能同源物纺锤体极体(Spindlepolebody，SPB)嵌在核膜上，在酵母细胞分裂时组织细胞核纺锤体微管成核。尽管高等真核生物中心体与酵母SPB形态上有明显的差别，但在蛋白质组成上却具有保守性。如芽殖酵母Spc110p、裂殖酵母Pcp1和脊椎动物的Pericentrin/Kendrin等中心体/SPB蛋白均由Coiled-coil结构域组成。最新研究显示酵母端粒结合蛋白spTaz1(TRF1同源物)与中心体蛋白Pcp1具有相互作用。但在人类细胞中端粒结合蛋白TRF1及其复合物是否与中心体蛋白有关以及作用机理尚不清楚。 本研究利用TRF1特异性抗体通过免疫共沉淀结合蛋白质肽指纹谱技术从分裂期细胞中分离鉴定了一个TRF1新的相互作用蛋白。该蛋白质与人类蛋白质数据库开放阅读框AAH03618编码的蛋白质相匹配，氨基酸序列分析显示该蛋白质氨基端有一个PH结构域，羧基端有二个Coiled-coil结构域，并且这两个Coiled-coil结构域形成SMC功能区。进一步序列比对分析发现该蛋白质与裂殖酵母中心体蛋白Pcp1同源。我们将该蛋白质命名为端粒相关的中心体蛋白1(Telomereassociatedcentrosomalprotein1，TACP1)。随后，从人睾丸cDNA文库中克隆了TACP1基因全长cDNA并进行了相应的亚克隆和突变。通过生化实验证实了TRF1与TACP1在体内的相互作用并鉴定了TACP1通过其羧基端与TRF1相互结合。免疫荧光染色定位研究显示TACP1在间期细胞与TRF1共同定位在端粒上，而细胞周期进展至有丝分裂中期时共定位于中心体。免疫电镜超微结构观察显示TACP1在分裂期细胞定位于中心粒周围。根据不同突变体定位结果提示TACP1中心体定位依赖于中间的Coiled-coil结构域。进一步的研究表明TRF1的中心体定位依赖于TACP1的相互作用。转染siRNA抑制TACP1的表达导致TRF1在中心体定位消失，这证实了TACP1对TRF1中心体定位的调控作用。该实验结果还提示TACP1对Tankyrase1的中心体定位也具有调控作用。通过siRNA抑制TACP1的表达可导致细胞中心体数目异常和多极纺锤体形成以及染色体排列异常，说明TACP1在维持染色体稳定性中具有重要调控作用。从单细胞生物酵母到人，TACP1蛋白在氨基酸序列和功能上都具有保守性，因此我们推测TACP1通过招募TRF1和Tankyrase1在中心体定位调控细胞有丝分裂的进程。 为深入探讨TACP1的细胞生物学功能，我们建立了TACP1稳定表达细胞株，进一步研究了TACP1在细胞周期进展过程中蛋白质水平的表达特征及其调控方式。Western免疫印迹检测显示，TACP1蛋白水平呈细胞周期性调节，以G2/M期为表达高峰，细胞退出有丝分裂后其蛋白水平快速下调，而这种下调可能是通过蛋白质酶体途径降解来实现的。双向电泳和去磷酸化实验证实TACP1是一个磷酸化蛋白，细胞进入有丝分裂期TACP1发生特异性磷酸化，这可能是TACP1在分裂期发生转位和对中心体功能调控的重要机制。通过质谱技术鉴定了TACP1的两个潜在磷酸化位点Thr221、Thr457，序列分析显示它们的磷酸化激酶可能分别是Nek2A和Plk1。TACP1过量表达导致细胞周期G1/S期阻滞，因此TACP1可能对细胞周期G1/S期转换具有调控作用。以上仅是TACP1生物学功能研究的开端，深入研究TACP1磷酸化机制以及在中心体上与其相互作用的蛋白质将有助于阐明TACP1对细胞周期的调控机理。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

前言

第一部分：端粒相关中心体蛋白TACP1与端粒结合蛋白TRF1相互作用，并调控TRF1在中心体的定位

材料和方法

实验结果

讨论

小结

参考文献

第二部分：TACP1在细胞周期中的表达特征与调控研究

材料和方法

实验结果

讨论

小结

参考文献

文献综述：端粒、端粒酶和端粒结合蛋白研究进展

附录 攻博期间发表和投稿论文、国际会议摘要及参加课题项目

致谢