遗传性凝血、抗凝因子缺陷症与静脉血栓栓塞相关性分析

摘要

机体的出凝血由凝血和抗凝两方面组成，两者间的动态平衡是机体保持正常止血功能的关键。本研究通过对FV抗原、活性和已报道过的FV单核苷酸多态性以及凝血酶原G20210A多态性的筛查，研究了其在中国人静脉血栓发病中的作用；同时在中国健康人群中对抗凝血酶（AT）、蛋白C（PC）和蛋白S（PS）等抗凝因子进行了大规模筛查，研究了遗传性抗凝蛋白缺陷症在中国健康人群当中的发病率。 在凝血过程中，FV的作用是作为活化的凝血因子Ⅹ(FⅩa)的辅因子，加速后者对凝血酶原的激活。活化蛋白C（APC）可通过裂解Fva 306位、506位、679位Arg和/或994位Lys，从而下调Fva的促凝活性。Bertina等发现Arg506Gln突变（FV Leiden）与APC抵抗（APCR）有关。APC对Fva Gln506的抑制仅有其对正常Fva抑制能力的1/10。自FV Leiden 发现以来，人们又相继发现Arg306Thr (FV Cambridge)和FV Arg306Gly (FV HongKong)，以及Asp79His，His1299Arg和 Ile359Thr与静脉血栓发病有关。1996年，Poort等报道凝血酶原（PT）基因3’端未转录区20210位核苷酸G→A的变异在首次血栓患者中的发生率为6.2％，健康人群的发生率为2.3％，杂合体静脉血栓形成的危险较正常人增加2.8倍。本研究旨在分析这些已报道过的单核苷酸多态性与中国汉族人静脉血栓发病的关系。我们收集了111例静脉血栓患者（均经静脉造影术确诊）和110例正常献血员为对照组，检测了其血浆FV的活性(FV:C)（一期法）及FV抗原（FV:Ag）（ELISA法），结果静脉血栓组（VTE组）FV:C 106.9％±28.0％，FV:Ag110.4％±33.3％；对照组FV:C 102.4％±30.9％，FV:Ag102.1％±24.1％。VTE组FV:Ag明显高对照组（P<0.05），FV:C两者之间无明显差异。我们设计了相关的单核苷酸多态性位点（FVAsp79His、Arg306Thr、Arg306Gly、Arg506Gln、Ile359Thr、His1299Arg和PT G20210A）的引物（或从文献获得），用PCR扩增相应的片断，纯化后用限制性片断长度多态性（PCR-RFLP）酶切进行检测，结果VTE组和对照组均无FV Asp79His、Arg306Thr、Arg306Gly、Arg506Gln、Ile359Thr和PT G20210A等多态性，5例静脉血栓栓塞症患者及3例正常人含有His1299Arg多态性。对所发现的多态性用直接测序法证实，并对含多态性的标本用直接测序法进行FV基因全部外显子编码区的筛查。结果该5例静脉血栓栓塞症患者同时伴有Met1736Val多态性，其中3例尚含Asp2194Gly多态性。 本研究收集了来自中国四个不同城市(北京、天津、上海、苏州)的3600例正常人，对其AT、PC、PS活性和APC-R进行了检测，然后以（均值-2SD）为界限，对表型降低的标本进行基因检测。通过对13例活性低于正常的标本AT全部外显子及其侧翼序列的直接测序我们检测到3个突变：Ser116Pro (T5342C), Arg47Cys (C2603T) 和Glu313del (7648-7650GAG del)。通过对21例活性低于正常的标本进行PC全部外显子及其侧翼序列的直接测序，我们检测到了9个基因突变，即Trp41Arg (T2972C), Ala121Thr (G3046A), Phe139Val (T6128G), Arg178Trp (C6245T), Lys150/151del(6164~6166AAGdel), Pro247Ser (C8454T), Gly282Ser (G8589A), Thr298Met (C8608T) 和 Thr315Ala (A8658G), 其中 Trp41Arg, Ala121Thr, Pro247Ser 和Thr315Ala 是没有报道过的。通过对41例活性低于正常的标本PS全部外显子及其侧翼序列的直接测序筛查，我们检测到2个未报道过的PS突变：Arg314Cys (CGT>TGT) 和Leu216Phe (TTG>TTC)。通过对APC-R阳性的标本进行相关的FV多态性位点（FV Arg306Thr、Arg306Gly、Arg506Gln 和 Ile359Thr）的筛查，并未发现阳性结果。 本研究还对肿瘤标志物基质金属蛋白酶2（MMP-2）及其抑制物（TIMP-2）基因表达水平与恶性肿瘤转移间的关系进行了研究。我们收集了结肠癌30例，胃癌19例，乳腺癌8例； 29例来自瑞金医院门诊体检正常人为对照。肿瘤组中，到截稿时已转移的病人为28例，未转移的病人为29例。我们收集所有研究对象外周血抽提RNA，用随机引物进行逆转录，然后用实时荧光定量PCR对管家基因及肿瘤标志物MMP-2及TIMP-2的mRNA表达水平进行研究。结果胃癌、结肠癌和乳腺癌患者MMP-2表达水平均高于对照组（P<0.005）；胃癌和结肠癌患者转移组MMP-2的表达和TIMP-2/MMP-2比值与未转移有明显差异（P<0.01）；结肠癌、胃癌患者TIMP-2/MMP-2比值降低的比率明显高于对照组（P<0.01），TIMP-2/MMP-2比值升高的比率明显低于对照组（P<0.05，P<0.005）；乳腺癌患者转移组TIMP-2/MMP-2比值低于正常的占85.7％。 从以上的研究结果中可以得出如下结论： 1．FV含量增高与静脉血栓栓塞症相关，中国人静脉血栓栓塞症与Asp79His、Arg306Thr、Arg306Gly、Arg506Gln、Ile359Thr和PT G20210A等 5种多态性基本无关；FV His1299Arg在VTE组中的分布频率高于对照组，但无明显差异。His1299Arg与Met1736Val和Asp2194Gly多态性在中国汉族人群中有连锁不平衡的特性。 2．中国人遗传性AT、PC和PS缺陷症的发生率分别为0.083％，0.25％和0.056％。中国人群AT、PC和PS基因缺陷中没有明显的突变热点。我们所报道的基因突变可能是中国人均易栓症的危险因素。 3．中国人APC-R与FVArg306Thr、Arg306Gly、Arg506Gln、Ile359Thr 和His1299Arg等多态性位点无关。 4．MMP-2的表达升高与恶性肿瘤的转移密切相关，TIMP-2的表达在转移组和未转移组间的差别无统计学意义，TIMP-2/MMP-2比值对恶性肿瘤转移和预后判断较MMP-2更为可靠。