毛细管电泳与化学发光/生物发光联用技术用于单细胞分析

摘要

单个细胞的分析化学正在形成, 它已成为分析化学前沿领域中的热门课题。单细胞分析将人们对生物微环境的认识提升到一个更深的更清晰的层次。比起常规细胞分析，单细胞分析注重细胞个体间的差异，可以检测到被平均结果所掩盖掉的重要生物信息，这在疾病早期的诊断和预防方面是非常重要的。而且对作为一个相对独立生物功能体的单细胞中的一些重要组分进行高效、灵敏地检测，将有助于阐明一些重要的细胞生理过程。在单细胞分析方法方面，高效液相色谱法以及80年代发展起来的开管液相色谱和毛细管电泳(CE)微柱分离方法由于质量检测限低、分离效率高, 已成功地用于单细胞多组分的定量检测。其中，由于CE进样量小, 可操作性强, 分离快速、高效, 因而它在单细胞的多组分分析中发挥着越来越重要的作用。到目前为止，在众多CE联用检测方法中，激光诱导荧光检测和电化学检测与CE联用方法成为主要的单细胞分析工具。但由于这两种方法仪器结构复杂，有时还需对无荧光或者无电活性的组分进行衍生，操作比较繁琐，所以有待人们探索新的用于单细胞分析的方法。CE-CL方法和CE-BL方法结合了CE的高效分离优势以及CL、BL检测方法的超高灵敏、简单易行等优势，将为单细胞分析提供新的分析方法的选择。 本文探索了毛细管电泳与化学发光检测联用方法（CE-CL）以及毛细管电泳与生物发光检测联用方法（CE-BL）用于单细胞分析的可行性，用以为目前的单细胞分析提供两种新的分析方法，使人们可以从更多的侧面对目标细胞有所了解，从而更加清晰的掌握细胞的生命过程以及和细胞相关的生理过程。 在本文中，选定具有重要生理以及临床意义的人体血红细胞作为单细胞分析的对象，首先探索了采用CE-CL方法对其内部重要的功能组分－血红蛋白（Hb）－进行定性定量分析的可行性： 1. 根据课题组以往的研究结果，选用具有超高检测灵敏度的鲁米诺－过氧化氢化学发光反应体系作为血红蛋白的检测体系。 2. 为了提高检测体系检测血红蛋白的灵敏度以达到可以检测单个血红细胞的水平，在CE-CL条件下，对检测体系中诸如检测模式、试剂混合模式、缓冲溶液pH值、反应试剂浓度以及检测位置等重要因素进行了优化。 3. 将人体血液直接稀释作为样品，应用优化好的实验条件对六个不同浓度的血红蛋白样品进行了分离检测并绘制了样品的标准曲线，线性范围在1.7 mg mL-1 到 6.8 mg mL-1之间，线性系数为0.997，检测限达到0.17mg mL-1（大约2.2pg，S/N=3）。 4. 摸索对血红细胞的操作条件，简化细胞进样操作。在以往的单细胞分析中，细胞进样需要使用倒置生物显微镜甚至三维微操作器的辅助，虽然倒置生物显微镜可以为细胞分析提供更广阔的操作平台，但其价格也十分昂贵。发挥实验室现有资源的优势，使用一台普通生物显微镜以及自行设计的细胞进样器实现了单个血红细胞进样。这个方法简单、廉价而且省时，一般30s便可完成细胞进样。 5. 完成了若干单个血红细胞的进样以及检测，得到比较强烈的信号。为了进一步考察方法的可靠性，连续对26个单个血红细胞进样检测，将结果进行统计分析，得到这26个血红细胞中血红蛋白的平均含量是23.6pg，相对标准偏差（RSD）为21.5％。 这是首次将CE-CL方法应用于单细胞分析。在成功实现CE-CL方法检测单细胞中血红蛋白的基础上，进一步探索了采用CE-BL方法对单个血红细胞中另一重要的功能组分－三磷酸腺苷（ATP）－进行定性定量分析的可行性： 1.采用专属性较强，检测灵敏度超高的荧光素酶生物发光反应体系作为ATP的检测体系。 2.首次将毛细管电泳与生物发光检测相联用。考虑到这个检测体系中相互作用因素较多，而且易受杂质干扰而被猝灭，所以首先我们对检测体系中诸如试剂中的含氧量，荧光素酶缓冲溶液体系的基底、pH值、流速以及荧光素酶缓冲溶液体系中不同阴离子对体系的猝灭作用、增强剂浓度等重要因素进行了系统的优化。 3.在优化好的CE-BL实验条件下，对不同浓度的ATP样品进行了进行了定量分析。得到样品的线性范围为1～50mM，线性相关系数为0.99988，迁移时间和峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为3.1％和9.6％，检测限1％mM（约为10-14mol ，S/N=3）。 4.提取了血红细胞中的ATP并进样分析。从结果估算得到，得到的ATP检测限相当于100个左右血红细胞中ATP的含量。由于实验条件限制以及时间有限，未能继续深入研究以达到对一个血红细胞中ATP进行检测的水平。