AE1在胃和结肠腺癌组织中的表达及其致癌作用的研究

摘要

阴离子交换蛋白1（anion exchanger，AE1）又名带3蛋白，是存在于红细胞膜上的主要内在性糖蛋白质，介导Cl-和HCO3-跨膜交换过程，调节细胞内的pH值。我们在对AE1C端域结构与功能进行研究的过程中发现并报道了AE1与关键的肿瘤抑制蛋白（p16）直接相互作用。这是国内外关于膜蛋白质与p16结构与功能相关的首次报道。 P16通过与CDK4/CDK6直接相互作用负调节细胞周期。由于在大量的临床肿瘤病例中发现了高频率的p16缺失和突变，使之与p53一样成为众多肿瘤相关蛋白中重要的研究目标。十余年来基础和临床研究发现p16除调节细胞周期外，还有其他多重生物学功能，但是，这些研究主要将目光集中在p16调节的对象而忽略了（或没有突破）p16本身受哪些因素的调控。P16与AE1相互作用的发现，为AE1及p16功能的调控提供了新的研究线索。 为深入研究AE1和p16相关的生理和病理学意义，我们对6种肿瘤细胞系AE1、AE2和p16的表达进行了检测，Western blotting结果显示所有肿瘤细胞都与正常组织一样表达AE家族成员AE2，但AE1异常表达在胃腺癌和结肠腺癌细胞（正常组织不表达AE1），采用免疫细胞化学及膜浆分离的方法对两种肿瘤细胞AE1和AE2进行定位发现AE2主要定位于细胞膜，而AE1主要分布在细胞浆。通过核浆分离对p16在细胞内的表达进行检测，结果显示该蛋白也异常分布在胃腺癌和结肠腺癌细胞浆，这一结果提示p16的胞浆分布可能与AE1的异常表达相关，Co-IP证明了内源性AE1和p16在两种肿瘤细胞内相互作用。由于AE1和AE2是调节细胞pH值的重要蛋白质，AE1的异常表达可能影响细胞pH的正常调节，因此，我们采用离子成像分析系统对单个肿瘤细胞的pH进行检测，结果发现胃腺癌和结肠腺癌比其他肿瘤细胞偏碱性。为排除p16在细胞浆内的分布源于细胞内pH的改变的可能性，本研究将胃腺癌和结肠腺癌细胞培养在酸性环境（pH6.0）中12-72小时，结果证明胃腺癌细胞p16的表达水平在酸性环境培养下36-48小时升高、72小时下降。结肠腺癌细胞p16的表达水平不变化。P16在两种肿瘤细胞浆内的定位未受酸性pH的影响。上述结果说明p16在两种肿瘤细胞浆内分布是通过与AE1直接相互作用而被扣押。在胃腺癌和结肠腺癌细胞过表达AE1扣押了更多的p16，而采用RNAi技术将AE1 knockdown，使p16释放并重新定位于细胞核。稳定knockdown AE1的肿瘤单克隆细胞出现生长抑制和死亡。通过本研究我们提出肿瘤发生相关的p16功能失调的新机制。 本研究进一步对临床胃腺癌和结肠腺癌的术后组织进行了免疫组织化学和Western blotting分析，所检测的83.33％胃腺癌和56.52％结肠腺癌组织中有AE1异常表达并伴随p16的异常。