敌敌畏胁迫下深绿木霉(Trichoderma atroviride)ABC转运蛋白表达与功能分析

摘要

木霉菌对有机磷农药的耐受性是其生物降解农药残留的重要前提，因此，研究ABC转运蛋白在木霉菌耐受敌敌畏中的作用具有重要意义。
　　利用RNA-seq转录组分析对深绿木霉T23中敌敌畏耐受相关基因进行挖掘，共得到5382个差异表达基因，从中鉴定出137个hex1调控下的敌敌畏胁迫应答基因，其中25个基因参与转运过程。KEGG代谢通路分析表明ABC转运蛋白在敌敌畏耐受中起到重要作用。通过保守区域BLAST，在深绿木霉基因组中检索到31个耐药相关ABC转运蛋白基因，根据转录组分析结果与基因功能注释从中筛选7个进行表达分析。
　　采用荧光定量方法分析了加入敌敌畏胁迫0h、2h、6h和24h后，深绿木霉中7个候选ABC转运蛋白基因的表达变化，发现PDR、MRP、MDR三个亚家族中各自具有类似的表达变化趋势，其中一个PDR型基因在6 h的表达量上调3000倍以上，命名为TaPdr2；同样地，分析了深绿木霉T23、?hex1以及hex1回补株中，ABC转运蛋白基因的表达差异，发现hex1敲除后的ABC转运蛋白表达显著上调，而敌敌畏胁迫加入后，表达量显著降低。
　　采用兼并引物同源克隆在深绿木霉T23基因组中扩增得到TaPdr2与TaMrp1基因并测序其全长序列，分析了TaPdr2与TaMrp1的系统发生树并对其蛋白结构进行了预测。TaPdr2转录本具有315bp的3’端UTR序列，与PDR5以及CDR转运蛋白亚家族有很高同源性，TaPDR2与TaMRP1蛋白都位于细胞膜。
　　采用ATMT介导的同源重组基因敲除，成功获得插入位置正确的TaPdr2敲除子。通过分析敲除子与野生型的表型差异，发现敲除TaPdr2基因后，深绿木霉敌敌畏耐受能力显著降低，敌敌畏胁迫下菌丝麦角甾醇含量降低约50％，电解质外渗变化不显著。

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第一章 绪论

1.1有机磷农药污染及其修复

1.2真菌耐受性研究

1.3 ABC转运蛋白及其在耐药性中的作用

1.4基因表达与功能分析方法

1.5论文的研究意义与内容

第二章 敌敌畏胁迫应答基因筛选

2.1引言

2.2材料与方法

2.3结果与分析

2.4讨论

2.5本章小结

第三章 敌敌畏胁迫下ABC转运蛋白基因表达分析

3.1引言

3.2材料与方法

3.3结果与分析

3.4讨论

3.5本章小结

第四章 深绿木霉ABC转运蛋白基因的同源克隆

4.1引言

4.2材料与方法

4.3结果与分析

4.4讨论

4.5本章小结

第五章 深绿木霉ABC转运蛋白基因功能分析

5.1引言

5.2材料与方法

5.3结果与分析

5.4讨论

5.5本章小结

第六章 总结

6.1主要工作与结论

6.2论文创新点

6.3后续工作展望

致谢

参考文献

附表

攻读硕士学位期间已发表或录用的论文