神经生长因子促进辣椒素诱导的背根神经节神经元P物质的释放

摘要

在众多的神经营养因子中，对感觉神经元具有影响作用而且被研究的最多的是神经生长因子(nerve growth factor，NGF)。NGF不仅对正在发育的神经系统中神经元的存活、分化和成熟等方面产生重要影响，而且在动物的整个生命过程中起着广泛的作用。近年来，有许多研究证明，NGF对受刺激或损伤的背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)神经元结构及功能的可塑性具有影响，NGF能够介导DRG神经元的细胞内事件，如神经元突起内线粒体的运输或聚集以及细胞内钙离子浓度的变化等。最近的研究表明NGF除了具有神经营养作用以外，还可在感觉神经元感受伤害性刺激的过程中发挥作用。NGF可以增加感受伤害性刺激反应的敏感性以及初级传入神经元对辣椒素的敏感性。组织炎症时NGF与炎症过程中痛觉过敏的发生机制有关。辣椒素引起肽类神经递质的释放也与痛觉有关。辣椒素通过位于初级传入神经元细胞膜上的辣椒素受体(vanilloid receptor 1，VRl)起作用，并引起感觉神经递质的释放而实现其有关的调控功能。P物质(substance P，SP)被确认为初级传入神经元的神经递质，可刺激上级神经元向上传递痛觉。SP除了参与感受伤害性刺激以外，还介导炎症反应。在炎症过程中，NGF所介导的痛觉过敏与辣椒素引起神经递质释放之间的作用关系及其作用机制目前尚不清楚。因此，本研究在体外建立胎鼠分散培养的DRG细胞模型，在培养液中分别加入不同浓度的NGF孵育DRG神经元，72h后用RT-PCR方法检测SP mRNA和VRl mRNA的表达，并用辣椒素诱发神经递质的释放，用放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)法分析辣椒素孵育前、后SP的释放量，用共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscope，CLSM)检测神经元胞内[Ca2+]i的变化，分析NGF对辣椒素诱发的DRG神经元神经递质SP释放的影响作用及其作用机制。经以上一系列实验得到了如下实验结果。(1)经倒置相差显微镜活细胞观察，有NGF孵育的DRG神经元形成的神经纤维网比没有加NGF的标本更加密集。(2)有NGF孵育的标本与对照组相比，经MAP2和DAPI双标记的DRG神经元数目增加。(3)有NGF孵育的标本与对照组相比，经RT-PCR检测SPmRNA表达增加，而且呈剂量依赖关系。(4)有NGF孵育的标本与对照组相比，经RT-PCR检测VRl mRNA表达增加，并呈剂量依赖关系。(5)用NGF孵育的DRG神经元，SP基础释放量和由辣椒素刺激后诱发的SP释放量均较对照组显著性增加，并且由辣椒素诱发的SP释放量与NGF呈剂量依赖关系。(6)用辣椒素孵育后，DRG神经元细胞内钙离子荧光强度明显增强。 以上结果表明：(1)NGF能促进体外分散培养的DRG神经元生长并且使DRG神经元的数目增加，能促进DRG神经元的存活。(2)NGF能促进DRG神经元SP mRNA的表达，能促进体外培养的DRG神经元肽类神经递质的合成，增加DRG神经元肽类神经递质的含量。(3)NGF能促进DRG神经元VRlmRNA的表达，能增加DRG神经元对辣椒素的敏感性。(4)辣椒素能明显诱发SP的释放，NGF不仅可增加SP的基础释放量，而且可明显增加辣椒素诱发的SP释放量。其作用机制可能是改善了神经元的功能状态，提高了神经元内SP的含量，增加了DRG神经元对辣椒素的敏感性。(5)辣椒素能刺激DRG神经元细胞内钙离子浓度升高，肽类神经递质的释放可能与神经元胞内钙离子浓度的升高有一定的关系。 总之，DRG神经元对NGF具有反应性，NGF可引起由辣椒素刺激诱发的神经递质释放量的增加，可能是由于以下几方面的原因：一是NGF使DRG神经元的数目增加；二是NGF改善了神经元的生长状态，使神经递质的合成增加；三是NGF促进了VR1受体的表达或可能增加了VR1受体的敏感性。

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