柿叶黄酮类化合物对D-半乳糖致衰老小鼠的抗炎、抗氧化脑保护作用

摘要

背景：随着人口老龄化进程的日益加剧，衰老及脑老化问题越来越引起人们的重视。衰老及脑老化是一种正常的生理现象，倘若脑老化进展过快，便可能形成病理性的神经系统退行性病变，如阿尔茨海默病、帕金森病等，造成重大的社会及经济负担[1]。神经变性疾病因其不可逆性，目前尚缺乏有效缓解疾病进展的药物，因此探讨脑老化机理及研发有效延缓衰老、保护脑损伤的药物，对防治神经系统退行性疾病、提高老年人生活质量有重要意义。D-半乳糖(D-galactose，D-gal)所致亚急性衰老模型是目前国内应用较为广泛的衰老模型，该模型具有造模周期短、结果较为稳定、节省时间及资金等优点，被广泛应用于老化机制、抗衰老药物的药效学研究[2，3]。该模型是通过给予小鼠皮下连续注射大剂量D-半乳糖，造成机体糖代谢紊乱而建立的。黄酮类化合物广泛存在于蔬菜、水果、茶叶等多种天然植物中。研究表明，其具有清除自由基、抗炎、抗过敏、抗病毒、抑制增殖和抗致癌活性等多种生物学活性[4]。近年来，黄酮类化合物潜在的调节神经元功能，预防年龄相关的神经变性疾病的作用越来越引起重视。黄酮类物质对神经系统的作用包括保护神经元免于神经毒素损伤、抑制神经炎性反应、减轻氧化应激损伤、调节多种细胞信号通路、促进记忆、学习和认知功能等多方面[5，6]。柿叶提取物已被应用于临床防治多种心脑血管疾病，黄酮类物质为其主要有效成分，然而其延缓脑衰老的作用及机制尚不十分明确。本实验采用国内应用较多的D-半乳糖所致亚急性衰老拟痴呆模型，探讨柿叶中黄酮类化合物延缓脑老化作用及机制。
　　目的：采用D-半乳糖建立亚急性衰老小鼠模型，通过Morris水迷宫试验、脑内氧化应激指标检测试剂盒、AGEs/RAGE/NF-κβ炎症通路相关指标采用Westernblot、免疫组织化学及ELISA检测，探讨柿叶中黄酮类提取物对衰老小鼠行为学、脑内氧化应激及炎症水平的影响。
　　方法：40只十二周龄雄性昆明小鼠，随机分为正常对照组(NC组)、模型组(D-gal组)、柿叶黄酮低剂量治疗组（F1组）、柿叶黄酮高剂量治疗组（F2组）。D-gal组及柿叶黄酮治疗组于颈背部皮下注射D-半乳糖100 mg/(kg·d)，连续用药60天建立衰老模型，F1组和F2组分别以40、80 mg/(kg·d)的柿叶黄酮提取物灌胃干预。对照组与模型组以同样方法给予等体积生理盐水。应用Morris水迷宫试验测试各组小鼠逃避潜伏期(escape latency, EL)及穿越平台次数;试剂盒测定小鼠脑组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量;酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)及免疫组织化学方法检测脑组织炎症因子肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α已）、白介素-1β(interleukin-lbeta，IL-1β)的表达;蛋白印迹技术测定晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)及其受体(receptor foradvanced glycation end products，RAGE)、核转录因子(nuclear transcriptionfactor-κB，NF-κB)的含量。
　　结果：⑴与NC组相比，D-gal组逃避潜伏期延长(P＜0.01)、穿越平台次数减少(P＜0.01)， F1组和F2组较D-gal组EL明显降低（P＜0.05，P＜0.01）、穿越平台次数显著增加(P＜0.01，P＜0.01)。⑵与NC相比，D-gal组小鼠脑组织SOD、GSH-Px酶活性显著降低(P＜0.01，P＜0.01)，而MDA含量升高明显（P＜0.01）。F1组及F2组较D-gal组SOD酶活性升高（P＜0.01，P＜0.01）、GSH-Px酶活性明显升高(P＜0.05，P＜0.01)，而MDA含量降低（P＜0.01，P＜0.01）。⑶D-gal组小鼠大脑皮层及海马TNF-α、IL-1β着色呈棕黄色，阳性细胞数最多，平均光密度值较NC组增加，差异具有显著性(P＜0.01，P＜0.01); F1组小鼠大脑皮层及海马TNF-α、IL-1β着色较D-gal组稍浅，阳性细胞数减少，平均光密度值明显减弱（P＜0.01，P＜0.01）。F2组小鼠大脑皮层及海马TNF-α、1L-1β与D-gal组相比着色很浅，阳性细胞数很少，平均光密度值明显减弱（P＜0.01，P＜0.01）。⑷D-gal组TNF-α和IL-1β较NC组升高明显(P＜0.01，P＜0.01)，F1组和F2组TNF-α较D-gal组明显降低（P＜0.01，P＜0.01），IL-1β较D-gal组明显降低（P＜0.01，P＜0.01），F2组较F1组改变更为明显(P＜0.01)。⑸D-gal组AGEs、RAGE、phospho-NF-κB蛋白表达较NC组升高明显(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01)， F1组AGEs、RAGE、phospho-NF-κB蛋白表达较D-gal组明显降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05），F2组AGEs、RAGE、phospho-NF-κB较D-gal组明显降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）。
　　结论：柿叶黄酮类化合物能够明显改善亚急性衰老小鼠学习记忆能力，提高脑组织的抗氧化能力，降低脑内炎症水平，具有延缓脑衰老的作用。

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摘要

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结论

附表

附图

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