载阿伦磷酸钠PLGA微球的磷酸钙骨水泥复合组织工程骨修复兔股骨髁骨缺损的实验研究

摘要

目的：骨缺损的治疗是骨科医生及科研工作者经常面临的难题。创伤、感染和骨肿瘤等致病因素导致的骨缺损难以自身愈合，其引起的功能丧失将影响患者的治疗效果和生活质量。在骨缺损的临床治疗中，经常遇到结构性骨缺损，以及骨折愈合不良、愈合困难甚至不愈合，严重时会导致骨不连等。临床上用于修复骨缺损的替代材料包括自体骨移植、同种异体骨移植和人工骨材料。自体骨移植是目前临床治疗骨缺损的金标准，其是指移植的骨组织在同一个体的体内，由一处移向另一处。人体某些部位的骨组织被取出后，基本不会遗留明显的功能障碍，而这些部位的骨组织往往是自体骨移植的理想供骨。自体骨移植所需的松质骨常取自锁骨或者髂骨，所需的皮质骨常取自胫骨或者腓骨。自体骨具有极高的成骨能力和很小的免疫反应，但却存在增加额外的创伤、来源极为有限、延长手术时间、增加失血量和手术感染的潜在可能性以及持续的慢性疼痛等缺点，从而限制了其临床应用。同种异体骨移植是指同种类的一个个体给另一个个体的骨组织移植。移植的骨组织具有不同的遗传特征，同受体组织会发生较为严重的免疫排斥反应及疾病传播的潜在危险。其中，由同一结合子发育而来的两个个体间的骨组织移植，称为同基因骨组织移植。在这种情况下，两个个体的遗传特征较为接近，可无免疫排斥反应或仅有轻微的排斥反应。同种异体骨移植虽然来源比自体骨移植丰富，但其仍然存在免疫排斥反应、愈合缓慢以及可能导致疾病的传播与交叉感染等问题。人工骨材料是指一类可对机体骨组织进行修复、替代与再生，具有特殊功能作用的骨组织替代材料。该类人工材料在临床的应用，为患者较快的恢复正常的生理结构和功能提供了可能，同时也避免了采用自体骨移植和同种异体骨移植所带来的各种问题。人工骨材料按结构或性质可分为无机骨材料、有机骨材料和复合骨材料。人工骨材料可填充骨缺损部位，但不能诱导新生的骨组织生成，人工骨材料的材料学、生物学性能以及降解能力等问题均有待进一步解决。构建复合骨替代材料即组织工程骨成为当今骨缺损治疗研究的热点，将促进骨愈合的药物与基质材料混合后联合治疗骨缺损是近来研究较多的一种方法。本项研究采用复乳溶剂蒸发法制备载阿仑膦酸钠PLGA微球并将其与磷酸钙骨水泥混合构建构的载阿伦磷酸钠/磷酸钙骨水泥复合组织工程骨，首先对其进行载药量及其释放规律、孔径大小、孔隙率和力学性能等材料学特性的研究;其次通过体外实验观察其对兔骨髓间充质干细胞增殖及成骨诱导能力的效果评价其体外生物相容性和成骨性;最后通过构建兔股骨髁骨缺损模型，将载阿伦磷酸钠/PLGA/磷酸钙复合组织工程骨植入骨缺损部位，通过影像学和组织学指标评价其体内生物相容性和成骨性。本项实验旨在研究制备搭载阿伦磷酸钠的PLGA微球与磷酸钙骨水泥复合后的组织工程骨，评估其体外和体内生物相容性和成骨活性，探讨其修复兔股骨髁骨缺损的效果及加速修复骨缺损的作用。本项研究有望能为临床促进骨缺损区修复提供一种新的治疗方法。本项研究分为以下三部分:(1)阿伦磷酸钠/PLGA/CPC组织工程骨的材料学性质研究;(2)阿伦磷酸钠/PLGA/CPC组织工程骨的体外生物相容性和成骨分化活性的研究;(3)阿伦磷酸钠/PLGA/CPC组织工程骨的体内生物相容性和促进骨缺损愈合的研究。
　　方法：⑴运用复乳溶剂蒸发法(W/O/W)制备载阿伦磷酸钠PLGA微球。采用JSM-6390扫描电镜观察微球的微观形态，测量其粒径大小和分布情况;采用酶标仪测定载阿伦磷酸钠PLGA微球的载药和缓释性能。微球与磷酸钙骨水泥混合制备阿伦磷酸钠/PLGA/CPC复合组织工程骨。采用阿基米德法测定组织工程骨的孔隙率;采用JSM-6390扫描电镜测量组织工程骨的孔径大小;采用RGD-5型万用测试仪测定组织工程骨的力学性能。⑵Percoll密度梯度分离法获取兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)，体外培养纯化，倒置显微镜观察其生长状态。分别将阿伦磷酸钠/PLGA/CPC复合组织工程骨和单纯PLGA/CPC组织工程骨与生长状况良好的第三代兔骨髓间充质干细胞共培养，通过扫描电镜观察细胞生长形态;采用CCK-8活细胞计数实验测定细胞的黏附和增殖;采用流式细胞周期测定材料对于细胞周期的影响;碱性磷酸酶活性和碱性磷酸酶染色评估其对细胞的成骨分化活性。⑶山东大学动物实验中心提供的45只健康新西兰成年大白兔(23雌，22雄;体重2.0-3.0kg)，手术建立股骨髁骨缺损的模型，随机分为A、B、C3组，每组15只。A组为假手术组（单纯股骨髁骨缺损组），B组骨缺损后植入PLGA/CPC组织工程骨，C组骨缺损后植入阿伦磷酸钠/PLGA/CPC复合组织工程骨。每只动物均一侧行手术操作。术后6周和12周分批处死动物后取材评估，行大体解剖观察、X线摄片、Micro-CT扫描分析（骨覆盖率和骨密度值）和组织学观察。
　　结果：①复乳溶剂蒸发法(W/O/W)成功制备出外表圆润、粒径200-300μm、粒径分布均匀的载阿伦磷酸钠PLGA微球。载阿伦磷酸钠PLGA微球与单纯PLGA微球的外观、粒径大小和分布没有明显差异。PLGA微球对于阿伦磷酸钠的载药率为75.12％,可缓慢释放阿伦磷酸钠达28天。载阿仑膦酸钠/PLGA/CPC复合材料孔隙率67.43±4.2％，孔径213±95μm，抗压强度达到5.79±1.21Mp，与松质骨相当，可基本满足临床要求。载阿仑膦酸钠/PLGA/CPC复合材料与PLGA/CPC材料的孔隙率、孔径和抗压强度没有明显差异。②载阿仑膦酸钠/PLGA/CPC复合材料在体外对骨髓间充质干细胞有着良好的体外生物相容性和成骨分化活性。载阿仑膦酸钠/PLGA/CPC复合组织工程骨与细胞粘附性良好，粘附细胞的形态正常。载阿仑膦酸钠/PLGA/CPC复合组织工程骨组的黏附、增殖性显著增高(P＜0.05)。细胞接种后，载阿仑膦酸钠/PLGA/CPC复合组织工程骨组的细胞的分裂增殖速度显著高于单纯PLGA/CPC组织工程骨和空白对照组(P＜0.05)。载阿仑膦酸钠/PLGA/CPC复合组织工程骨组的碱性磷酸酶活性显著增高(P＜0.05)，碱性磷酸酶染色的阳性细胞也显著高于单纯PLGA/CPC组织工程骨和空白对照组。③兔股骨髁骨缺损动物实验显示载阿仑膦酸钠/PLGA/CPC复合组织工程骨同样有着良好的体内生物相容性和成骨分化活性。植入后6周和12周，复合材料组的骨缺损修复均优于对照组。假手术组（单纯股骨髁骨缺损组）股骨髁骨缺损未见明显愈合;X线摄片示骨缺损处透光明显;Micro-CT显示骨覆盖率(bonecoverage)在6周和12周分别为3.40±2.25％和6.10±4.48％，骨密度值(BMD)在6周和12周分别为31.04±5.8mg/cm3和50.80±8.8mg/cm3;HE染色显示骨缺损处可见大量的纤维细胞，少见新骨形成。PLGA/CPC组织工程骨组股骨髁骨缺损见部分愈合;X线摄片示骨缺损处透光较弱;Micro-CT显示骨覆盖率在6周和12周分别为12.89±5.74％和20.24±9.25％，骨密度值在6周和12周分别为57.08±8.4mg/cm3和81.80±10.8mg/cm3;HE染色示骨缺损处可见少量的纤维细胞，可见部分新骨形成，但新生骨小梁较为薄弱。阿伦磷酸钠/PLGA/CPC复合组织工程骨组股骨髁骨缺损见基本愈合;X线摄片示骨缺损处透光最弱;Micro-CT显示骨覆盖率在6周和12周分别为25.78±6.89％和45.06±11.62％，骨密度值在6周和12周分别为88.92±9.9mg/cm3和115.98±12.2mg/cm3;HE染色示骨缺损处可见极少量的纤维细胞，可见大量的新骨形成，新生骨小梁粗大。
　　结论：⑴PLGA是良好的阿伦磷酸钠的载体和缓释体，载阿伦磷酸钠的PLGA微球在降解后可使阿伦磷酸钠缓慢释放。⑵载阿伦磷酸钠/PLGA/CPC复合组织工程骨具有良好的材料学性能，有合适的孔径结构和力学性能。⑶体外实验显示载阿伦磷酸钠/PLGA/CPC复合组织工程骨具有良好的生物相容性和成骨活性，可促进兔骨髓间充质干细胞的黏附、增殖和成骨分化。⑷动物实验证实载阿伦磷酸钠/PLGA/CPC复合组织工程骨治疗骨缺损效果可靠，能够促进兔股骨髁骨缺损局部的新骨形成，加速骨缺损的修复和愈合。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

第二章 阿伦磷酸钠／PLGA／CPC复合组织工程骨的材料学性质研究

材料和方法

结果

讨论

结论

第三章 阿伦磷酸钠／PLGA／CPC复合组织工程骨的体外生物相容性和成骨分化活性的研究

材料和方法

结果

讨论

结论

第四章 阿伦磷酸钠／PLGA／CPC复合组织工程骨的体内生物相容性和促进骨缺损愈合的研究

材料和方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

致谢

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