白藜芦醇纳米混悬剂改善口服生物利用度及经鼻脑靶向递药系统研究

摘要

阿尔茨海默症(Alzheimer's disease，AD)为与年龄相关的退行性神经病变，导致记忆、认知功能衰退及行为能力受损。白藜芦醇(Resveratrol，Res)是来源于天然植物中的非黄酮类多酚物质，其潜在的对抗氧化、清除自由基的作用为AD的预防与治疗提供了理论基础。然而由于白藜芦醇差的水溶性，存在的血脑屏障不能有效地实现药物的脑部递送，成为限制其应用的主要瓶颈。
　　本课题主要目的是将白藜芦醇制备成纳米混悬剂，利用结冷胶离子敏感的性质，将白藜芦醇纳米混悬剂分散到结冷胶溶液中，构建以结冷胶为基质的原位凝胶，施用于鼻腔后，评价其制剂学特性、药动学及药效学特性，以期能有效地将药物传递到脑部，提高脑内浓度，为中枢系统疾病的治疗进行有意义的探索及提供新的给药途径。
　　本研究的主要内容包括白藜芦醇的处方前研究;白藜芦醇纳米混悬剂的工艺研究与处方筛选;白藜芦醇纳米混悬剂药动学特征及提高白藜芦醇生物利用度的方法;基于原位凝胶为载体的白藜芦醇纳米混悬剂离子敏感型鼻用凝胶的研究;在采用小鼠侧脑注射Aβ25-35建立AD模型的基础上，评价小鼠水迷宫行为及测定脑组织相关生化指标，探讨白藜芦醇经鼻腔给药后对AD的防治作用;以Aβ25-35损伤的PC12细胞作为AD细胞模型，观察白藜芦醇对PC12细胞的保护作用，并对其可能涉及的机制进行初步探讨。
　　依据紫外光谱扫描确定白藜芦醇最大吸收波长，采用HPLC法建立体外分析测定方法，测定不同介质中的饱和溶解度及油水分配系数。处方前研究结果显示，白藜芦醇在水中的溶解度约为16μg·mL-1，正辛醇-水中脂水分配系数logP约为2.3，根据药物低溶解性及高渗透性的特征，其属于生物药剂学BCS分类系统中的Ⅱ型药物。提示溶解度小导致较慢的溶出速度，可能是限制白藜芦醇吸收的主要原因。
　　比较高压均质法与反溶剂沉淀法两种常用的制备纳米混悬剂的方法，结果显示溶剂-反溶剂沉淀法可以获得符合要求的纳米混悬剂;采用Box-behnken design效应面实验，以粒径大小及粒径多分散指数为响应值，通过建立数学模型及数理统计分析考察药物浓度，稳定剂聚维酮PVPK17及表面活性剂F188的量对响应值的影响，以筛选最佳处方。优化后的处方组成为:白藜芦醇的含量为29.2(mg/ml)，0.38％的PVP K17及3.63％的Poloxamer188。考察了纳米混悬剂的冻干工艺，对冻干曲线进行分析以确定冻干工艺，筛选5％的甘露醇作为白藜芦醇纳米混悬剂的冻干保护剂。粒径及SEM结果表明，纳米混悬剂为类球状，粒径大小为145±6.56nm，PDI为0.279，Zeta-电势为-8.8±1.52 mV。DSC和X射线衍射测定结果表明，在制备纳米混悬剂的过程中，白藜芦醇的晶体形态发生了改变，可能为亚稳定型或无定型状态存在。红外光谱结果显示，白藜芦醇的结构没有发生改变，依然维持反式的空间结构特征，对于保证白藜芦醇的活性具有重要意义。白藜芦醇纳米混悬剂体外的溶出速率和饱和溶解度结果表明，与原料药相比，溶出速率加快，溶解度可以提高约11倍。
　　大鼠口服给药后的药动学结果表明:与普通混悬剂相比，口服给予白藜芦醇纳米混悬剂后，其Cmax、AUMC0→∞和AUC0→∞分别提高了3.2倍，1.4倍及1.33倍。与胡椒碱联合应用后可以使白藜芦醇在大鼠体内的Cmax、AUMC0→∞和AUC0→∞分别提高1.73，1.91及1.93。提示胡椒碱可以通过抑制葡萄糖醛酸转移酶的活性提高白藜芦醇在大鼠体内的生物利用度;通过凝聚法制备黄芩苷固体脂质纳米粒(baicalin solid lipid nanoparticles)，口给予黄芩苷固体脂质纳米粒能使白藜芦醇在大鼠体内的Cmax、AUMC0→∞和AUC0→∞分别提高161％，147％及164％，提示黄芩苷可以改善白藜芦醇在大鼠体内的生物利用度。
　　在白藜芦醇纳米混悬剂原位凝胶的制备过程中，采用结冷胶作为离子敏感型鼻用凝胶的基质材料，通过临界离子浓度、膨胀系数及持水能力评价结冷胶形成凝胶的性质，结果表明0.5％的结冷胶符合要求。流变学研究结果表明，形成的凝胶为典型的假塑性流体特征，其粘度与剪切速率有关，随剪切速率的增加呈明显降低趋势;频扫实验与应力实验表明结冷胶的流变学类型为典型的Cross模型，该体系表现出剪切稀化性、触变性及屈服应力的特点。与结冷胶溶液相比，质构分析结果显示当遇到阳离子形成凝胶时，其密度指数，浓稠度，内聚力，粘度等参数呈增大趋势，符合凝胶的要求。体外溶出实验结果提示，白藜芦醇纳米混悬剂原位凝胶体外释药过程遵循Higuchi方程，是以骨架扩散为主，兼有溶蚀行为的释放机制。
　　采用在体蟾蜍上颚纤毛模型、鸡胚绒毛尿囊膜模型及小鼠体内鼻腔粘膜组织病理切片模型综合考察白藜芦醇纳米混悬剂原位凝胶对鼻腔纤毛的毒性及刺激性，结果表明原位凝胶对鼻腔粘膜组织未出现明显损害，刺激性小，其安全性较好，可以用于鼻腔给药。
　　经鼻给药后药动学结果显示，白藜芦醇在脑组织中的AUC0-8h是静脉注射给药的2.88倍，脑靶向效率DTE为458.2％和经鼻直接入脑的百分比DTP为78.18％，表明经鼻腔给药可以有效地实现脑靶向递药。
　　本实验通过侧脑室注射Aβ25～35后会引起神经元细胞的衰退，出现记忆减退、认知功能障碍的症状，成功复制了AD的疾病模型。通过水迷宫实验研究了白藜芦醇对认知功能障碍大鼠学习记忆能力的改善作用及测定AD模型动物脑组织中胆碱能递质的变化探讨相关的治疗机制。鼻腔给予白藜芦醇纳米混悬剂原位凝胶后表现出更好地改善学习记忆方面的能力。通过测定胆碱能神经递质的生化指标结果证实了提高学习记忆的能力的原因，给予白藜芦醇后，能够降低乙酰胆碱酶的活性，提高乙酰胆碱转移酶的活力，从而增加神经递质乙酰胆碱的含量，改善其学习记忆功能。HE染色用以观察海马区域神经元的损伤程度，白藜芦醇可以对Aβ损伤的神经元产生保护作用。药效学结果表明白藜芦醇对AD模型小鼠的学习记忆能力减退有改善作用。
　　白藜芦醇纳米混悬剂及白藜芦醇原料药可以提高Aβ25～35损伤PC12细胞的存活率，对Aβ25～35诱导凋亡的神经细胞起到保护作用，其保护的作用方式可能是减少ROS的活性抑制氧化应激反应及调控线粒体相关Bax和Bcl-2蛋白表达实现的。
　　本文成功制备了基于白藜芦醇纳米混悬剂的离子敏感型原位凝胶，经鼻腔给药后可以提高药物到达脑部的药物浓度，增强对AD的防治，为鼻用制剂的进一步开发奠定理论基础。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

1 模型药物白藜芦醇的研究进展

2 纳米混悬剂的研究

3 经鼻脑靶向递药的研究

4 鼻腔用原位凝胶的研究

5 本课题设计思路

第一章 白藜芦醇纳米混悬剂处方前研究

1 仪器与试药

2 方法与结果

2．1 白藜芦醇分析方法的建立

2．2 白藜芦醇基本理化性质研究

3 讨论

4 小结

第二章 白藜芦醇纳米混悬剂的工艺研究与处方筛选

第一节 白藜芦醇纳米混悬剂的制备工艺

1 仪器与试药

2 方法与结果

3 讨论

4 小结

第二节 Box-behnken design优化白藜芦醇纳米混悬剂的处方研究

1 仪器与试药

2 方法与结果

3 讨论

4 小结

第三节 白藜芦醇纳米混悬剂物理化学性质的研究

1 仪器与试药

2 方法与结果

3 讨论

4 小结

第三章 白藜芦醇纳米混悬剂药动学及提高生物利用度的方法

第一节 白藜芦醇纳米混悬剂口服给药后大鼠体内药动学研究

1 材料与动物

2 实验方法与结果

3 讨论

第二节 胡椒碱对白藜芦醇纳米混悬剂给药后大鼠体内药动学的影响

1 材料与动物

2 实验方法与结果

3 讨论

第三节 黄芩苷固体脂质纳米粒对白藜芦醇纳米混悬剂给药后大鼠体内药动学的影响

1 材料与动物

2 实验方法与结果

3 讨论

第四章 白藜芦醇纳米混悬剂离子敏感型鼻用原位凝胶的研究

第一节 基于白藜芦醇纳米混悬剂的鼻用原位凝胶的制剂学特征

1 仪器与试药

2 方法与结果

3 讨论

4 小结

第二节 基于白藜芦醇纳米混悬剂的鼻用原位凝胶的安全性评价

1 仪器与试药

2 方法与结果

3 讨论

4 小结

第三节 白藜芦醇纳米混悬剂原位凝胶经鼻腔给药后脑内分布动力学研究

1 材料与动物

2 实验方法与结果

3 讨论

4 小结

第五章 基于白藜芦醇纳米混悬剂的原位凝胶经鼻给药后的药效学评价

1 材料与动物

1．1 仪器

1．2 试剂

1．3 实验动物

2 实验方法与结果

2．1 动物筛选

2．2 AD动物模型的制备

2．3 给药与分组

2．4 学习记忆能力的测定

2．5 脑组织中乙酰胆碱、乙酰胆碱酯酶及乙酰胆碱转移酶的测定

2．6 脑组织病理形态学观察

3 讨论

4 小结

第六章 白藜芦醇纳米混悬剂对Aβ25~35诱导PC12细胞损伤的保护作用

1 实验材料

1．1 仪器

1．2 试剂

2 实验方法与结果

2．1 PC12细胞损伤模型的建立

2．2 白藜芦醇对PC12细胞的影响

2．3 白藜芦醇对Aβ25~35损伤PC12细胞的影响

2．4 PC12细胞对白藜芦醇纳米混悬剂颗粒的摄取

2．5 PC12细胞内活性氧ROS测定

2．6 白藜芦醇对Aβ25~35溶液致细胞凋亡的影响

2．7 Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白的表达

3．讨论

4．小结

全文小结

参考文献

致谢

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