肿瘤微环境中基质成纤维细胞与人结直肠癌细胞的相互作用及其机制研究

摘要

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是常见的消化道肿瘤之一，全球每年新发病例120万，死亡病例超过60万。CRC的发病率和死亡率均呈现明显的上升趋势，然而全球CRC的治愈率却无明显改观。研究发现炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）尤其是溃疡性结肠炎(ulcerativecolitics，UC)发生结直肠癌的危险性随病程的延长呈倍数增长，其机制尚未完全阐明，其中局部组织微环境的慢性炎症状态可易化癌细胞转移及肿瘤微血管的形成。
　　各种内外环境因素，如炎症、应激等均可影响组织内微环境的稳定，从而导致疾病的发生。显然，肿瘤的发生离不开内外环境的影响，其中肿瘤微环境在其中产生了极其重要的影响。肿瘤细胞周围的间质细胞、免疫细胞以及各种细胞所分泌的细胞因子、免疫因子等构成了与肿瘤细胞相互作用的内环境，称之为肿瘤微环境(tumor environment，TME)。TME中的主要细胞成分包括炎症细胞、免疫细胞、癌相关巨噬细胞、癌相关成纤维细胞(cancerassociatedfibroblasts，CAFs)。肿瘤细胞与TME中这些的复杂的组成成分之间的相互作用可以为肿瘤细胞的增殖、转移提供良好的条件。细胞的增殖与生长必须以物质和能量代谢为基础，恶性克隆性增生的肿瘤细胞及TME的物质供应和能量代谢必然与正常细胞代谢不同，方可适应肿瘤细胞的失控性的的增值与侵袭转移。近来研究发现，CAFs作为TME中的主要成分，在肿瘤细胞的代谢重编中产生了十分重要的作用，加速了肿瘤细胞增殖和远处转移。
　　基于以上研究背景，本课题首先利用DSS诱导肠炎动物模型、DMH诱导结直肠癌模型、DSS联合DMH诱导炎症-癌症模型，探究炎性微环境在结直肠癌发生发展中的作用，以及炎性组织微环境中糖代谢的改变。进一步利用非接触式共培养体系，研究肿瘤微环境中结直肠癌细胞与CAFs成纤维细胞的相互作用关系，以及细胞内代谢关键酶的活性变化，并通过对CAFs代谢方式转换的分子机制的研究，使我们能够对肿瘤生长的微环境有更好的理解，进一步探讨和发现结直肠癌治疗的新靶点。
　　目的:
　　1.炎性微环境在结直肠癌发生发展中的作用，以及炎性组织微环境中糖代谢的改变。
　　2.研究肿瘤微环境基质成纤维细胞与结直肠癌细胞之间的相互作用，并进一步探讨潜在的分子机制。
　　方法:
　　1.建立肠炎动物模型、结直肠癌动物模型及炎症癌症模型。
　　2.将成纤维细胞CCD-18-co与结直肠癌细胞(LoVo、SW480、SW620)利用Transwell小室进行非接触式共培养。
　　3.MTT法检测共培养体系中成纤维细胞以及结直肠癌细胞的活力。
　　4.Western blot法检测共培养后蛋白表达量变化。
　　5.免疫荧光检测共培养后蛋白表达变化。
　　6.免疫组化检测正常结肠组织、炎症组织、及癌组织中增殖细胞核抗原(PCNA)、丙酮酸激酶(PKM2)、异柠檬酸脱氢酶(IDH2)的表达。
　　7.糖代谢关键酶活性检测:利用分光光度法检测肿瘤细胞PKM2、IDH2的活性变化。
　　结果:
　　1.通过病理学HE染色检测小鼠结肠组织的病理学改变，确定成功诱导建立了小鼠慢性炎症模型、结直肠癌症模型。
　　2.通过检测血清学TNF-α指标的含量变化、PCNA增殖指数以及HE染色的结果，发现DMH+DSS诱导的小鼠癌变模型较单独DMH诱导的结直肠癌模型肿瘤发生率更高、发展速度更快而且恶性程度更高。
　　3.免疫组化检测结肠组织中糖代谢关键酶PKM2在DMH和DMH+DSS组中癌细胞与基质细胞中的表达均增加。然而IDH2仅表现为在癌细胞中表达增加，基质细胞中表达却未增加。
　　4.利用培养过CCD-18-co、结直肠癌细胞的培养基分别培养结直肠癌细胞、CCD-18-co细胞，MTT结果显示CCD-18-co和结直肠癌细胞具有相互促进增殖效应。
　　5.与CCD-18-co细胞共培养后，结直肠癌细胞中糖酵解关键酶GAPDH、PKM2及柠檬酸循环中关键酶IDH2的表达均增加;而CCD-18-co细胞糖酵解关键酶活性增加，柠檬酸循环关键酶的表达却下降。
　　6.与结直肠癌细胞共培养后，CCD-18-co细胞氧化应激关键酶、自噬相关蛋白的表达均增加。
　　7.应用氧化应激及自噬抑制剂之后检测共培养后的细胞变化，发现各相关蛋白的表达均表现逆转现象。
　　结论:
　　1.持续的炎症反应可影响组织微环境中细胞的糖代谢状况，促进细胞增殖，从而促进肿瘤的发生和发展。
　　2.肿瘤微环境中存在的成纤维细胞通过由相邻的肿瘤细胞所诱导的氧化应激与自噬，而影响结直肠癌细胞的新陈代谢过程，从而促进肿瘤细胞的增殖。因此，成纤维细胞很可能为结直肠癌治疗的一个潜在的靶点。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 DSS和DMH诱导的模型小鼠结肠组织糖代谢的研究

实验材料

实验方法

实验结果

小结

第二部分 肿瘤微环境中基质成纤维细胞对人结直肠癌细胞生物学作用及其机制研究

实验材料

实验方法

实验结果

小结

讨论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文