奇果菌素诱导卵巢癌细胞自噬形式死亡及机制研究

摘要

研究背景及目的:
　　卵巢癌(ovarian cancer，OC)在妇科恶性肿瘤中病死率高居首位，发病率仅次于宫颈癌、子宫内膜癌，其中上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)比例约85％～90％。由于早期卵巢癌（FIGO分期Ⅰ-Ⅱ期）无明显的临床症状和体征，多数卵巢癌患者在初诊时已发展为晚期（FIGO分期Ⅲ-Ⅳ期），伴有腹胀、腹水、腹腔癌灶播散种植等症状。上皮性卵巢癌的经典治疗方案以手术为主，术后辅以铂类为基础的化疗等综合治疗。绝大多数进展期病人（约70％～80％）在治疗后最终会发生远处转移，导致其5年总生存率较低（约30％～40％）。另外术后化疗等综合治疗有较大的副作用，如恶心、呕吐、骨髓抑制、疲乏、脱发等，严重影响患者生活质量，并在一定程度上阻碍了术后辅助治疗的进展，甚至很多患者出现铂类耐药等现象。因此，寻找新型的、有效的以及毒副反应低的抗卵巢癌药物，对提高其治疗的有效率、改善其预后及逆转卵巢癌化疗耐药等是十分有必要的。奇果菌素(Grifolin，2-trans，trans-farnesyl-5-methylresorcinol)，是一种从可食用的美洲蘑菇菌类地花菌(Albatrellus confluens)中萃取出来的次代代谢产物，类属于担子菌类。最初奇果菌素被验证具有降低血浆胆固醇浓度的功能，随后大量实验证实其强效的抗炎、抗病毒、免疫调节及抗癌活性，其中抗癌机制被广泛深入研究，已有研究发现奇果菌素发挥抗癌活性的机制包括抑制癌细胞的增殖、阻滞细胞周期、促进细胞凋亡、抑制癌细胞黏附、侵袭及迁移等。但在上皮性卵巢癌中抗癌活性及其机制尚未见报道。本文旨在研究奇果菌素对上皮性卵巢癌细胞系A2780和SK-OV-3增殖、自噬等能力的影响并对其作用机制进行初步探讨。
　　研究方法:
　　1.MTT法检测不同浓度奇果菌素作用A2780和SK-OV-3两种细胞不同时间的生存率。
　　2.流式细胞学吖啶橙染色法检测自噬囊泡、荧光显微镜下GFP-LC3自噬小体集合法、电镜检测自噬体等方法验证奇果菌素对A2780和SK-OV-3细胞系的自噬作用。
　　3.Western-blot法、免疫荧光法检测奇果菌素对A2780和SK-OV-3细胞中自噬相关蛋白分子的表达量以及自噬相关的Akt/mTOR/S6K信号通路中靶蛋白分子表达的调节。
　　4.应用自噬抑制剂氯喹及敲除自噬靶点分子LC3B，通过MTT法、流式细胞技术及Western-blot法反向证明奇果菌素对A2780细胞和SK-OV-3细胞的自噬诱导作用。
　　应用统计学软件SPSS18.0分析实验数据，P＜0.05统计学有差异。所有实验数据均经过三次不同实验所得，用平均数和标准差的方式表示。
　　研究结果:
　　1.奇果菌素可以抑制卵巢癌细胞增殖能力:MTT法检测奇果菌素作用前后A2780和SK-OV-3细胞的生长率，结果显示:奇果菌素对两种细胞系均有抑制增殖作用，表现出浓度梯度和时间梯度差异（P＜0.05）。
　　2.奇果菌素可以诱导卵巢癌细胞自噬作用:流式细胞学吖啶橙染色法、GFP-LC3小体集合试验、电子显微镜拍摄自噬体等结果显示:与对照组相比，奇果菌素作用的两种细胞系均检测到自噬的发生。Western-Blot法检测自噬相关靶点分子蛋白表达量、免疫荧光技术检测LC3B分子的荧光表达量，结果显示LC3B、Atg7、Beclin-1上调，P62下调;LC3B荧光亮度上调，验证了上述结果。反向验证法，联合应用自噬抑制剂氯喹、敲除LC3B分子，MTT法检测生存率、流式细胞术吖啶橙染色法检测自噬囊泡形成、Western-blot法检测敲除LC3B前后的A2780细胞和SK-OV-3细胞的自噬作用，进一步证实奇果菌素可以诱导卵巢癌细胞自噬作用，上述结果均具有统计学差异(P＜0.05)。
　　3.Western-blot法检测奇果菌素诱导卵巢癌细胞系自噬形式死亡相关信号通路:结果显示:与对照组相比，奇果菌素刺激后的细胞系表现出通路靶点分子磷酸化形式的蛋白表达量明显下调(P＜0.05)。
　　研究结论:
　　1.奇果菌素通过诱导卵巢癌细胞的自噬作用从而达到其促进癌细胞死亡的作用。
　　2.奇果菌素诱导卵巢癌细胞发生自噬形式的死亡是通过抑制Akt/mTOR/S6K信号通路完成的。

目录

声明

摘要

符号说明及缩略语表

前言

材料与方法

1．实验材料

2．实验方法

实验结果

1．奇果菌素抑制卵巢癌细胞增殖能力

2．奇果菌素诱导卵巢癌细胞自噬形式的死亡，从而达到其抗癌作用，通过以下3中不同的实验方法分别验证

3．Western-Blot法及免疫荧光技术验证奇果菌素对自噬相关靶蛋白的作用结果

4．反向验证实验结果

5．奇果菌素诱导卵巢癌细胞系自噬形式死亡相关信号通路的研究

讨论

结论

附图

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文