Lurap1调节斑马鱼早期胚胎形态发生运动的机理研究

摘要

Lurap1(leucine repeat adaptor protein1)，也被称为Lrap35a，是一个衔接蛋白。Lurap1在N端包含两个亮氨酸串连重复序列，在C端具有一个能与PDZ结构域相互结合的PDZ-binding基序。在体外培养的细胞中已被证明Lurap1的PDZ-binding基序和亮氨酸串联重复序列能分别与非传统MYO18A的PDZ结构域和肌强直营养不良激酶相关的Rac/Cdc42结合激酶MRCK结合，从而使得Lurap1与MYO18A和MRCK形成三聚体复合物，通过对肌动球蛋白逆流的调节作用进而调节细胞的迁移。虽然Lurap1蛋白在脊椎动物之间是高度保守的，但是在早期胚胎发育中它在调节细胞运动中的功能研究还未曾报道。
　　本论文中，利用TALENs技术制造了斑马鱼的lurap1无效突变体。发现，lurap1的杂合突变体胚胎发育正常，其合子的纯合突变体胚胎表现出较弱的形态发生缺陷，但是可以生长发育以及是可以生殖的。然而，通过将纯合体鱼进行杂交获得的母源合子突变体（MZlurap1）却表现出明显的下包延迟和集中延伸运动缺陷。高表达lurap1mRNA能够特异的拯救MZlurap1突变体胚胎的这些形态发生缺陷，这表明母源的lurap1在原肠胚期以及之前的时期应该是参与调节下包和集中延伸运动过程的。
　　斑马鱼胚胎下包的驱动力主要来源于两个方面，一是来自植物极卵黄皮层F-actin的拉力，另一个是来自胚盘深层细胞DCs的辐射嵌插运动。在MZlurap1突变体胚胎中EVL边缘细胞形状沿动植物极方向拉长程度较小，并且从YSL向植物极方向拉出的E-YSNs数量显著减少，这在一定程度上是由于MZlurap1原肠胚植物极卵黄皮层F-actin组装紊乱造成的。这种植物极卵黄皮层F-actin组装缺陷可能会导致EVL边缘的张力减弱以及E-YSN运动行为的异常。卵黄皮层F-actin组装缺陷只能是MZlurap1突变体胚胎下包延迟的部分原因，因为这种缺陷在同一批胚胎或者在不同批次的胚胎中差别较大，然而所有这些胚胎都表现出相似程度的下包缺陷，这就使进一步研究了胚盘中的细胞行为，Lurap1功能缺失还会引起DCs的辐射嵌插运动行为异常。进一步的分析表明MZlurap1细胞能够从WT细胞中分选出来，这是由于突变体细胞之间粘附力减弱造成的。总之，以上结果表明Lurap1通过调节植物极卵黄皮层F-actin组装以及促进细胞之间的粘附力来调节下包运动。
　　原肠作用是一个基本的形态发生事件，其需要极性的细胞行为来调整非对称的细胞运动，Wnt/PCP信号通路在这个过程中起着关键的作用。Dishevelled是一个重要且保守的脚手架蛋白，它能转导来自细胞膜受体的Wnt/PCP信号以对细胞骨架组织进行调节。然而，如何通过调节它的活性来激活下游的元件还不清楚。本论文中报道了Lurap1是一个与Dishevelled相互作用的蛋白，其在脊椎动物原肠作用过程中通过Wnt/PCP信号通路调节集中延伸运动。Lurap1功能缺失能够导致Dishevelled的膜定位增强和JNK活性增加。另外，Lurap1与Dishevelled和JNK均能够在功能上相互作用来调节集中延伸运动。以上结果表明Lurap1在原肠作用过程中能够调节细胞的极性和运动行为。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分 斑马鱼早期胚胎形态发生运动的调控机制

1．斑马鱼早期胚胎的形态发生运动

2．下包运动

2．1．下包的起始及运动过程

2．2．调节下包运动的机制

3．集中延伸运动

3．1．非经典Wnt信号通路

3．2．Wnt/PCP信号通路对集中延伸运动的调节

3．3．Wnt/Ca2+信号通路对集中延伸运动的调节

4．Lurap1相关研究

5．结论与展望

参考文献

第二部分 Lurap1通过调节植物极卵黄皮层F-actin组装和细胞粘附调节斑马鱼下包运动

1．引言

2．结果

2．3．敲除lurap1影响下包的形态发生

2．4．Lurap1能够拯救MZlurap1突变体胚胎下包延迟表型

2．5．Lurap1敲除会引起EVL边缘细胞形状和E-YSN运动行为异常

2．6．Lurap1调节植物极卵黄皮层F-actin的组装

2．7．Lurap1功能缺失导致DCs辐射嵌插运动行为异常

2．8．MZlurap1突变体细胞之间的粘附力减弱

3．结论和讨论

参考文献

第三部分 Lurap1与Dishevelled相互作用调节斑马鱼原肠胚形成中细胞的集中延伸运动

1．引言

2．结果

2．1．lurap1基因突变影响CE运动

2．2．Lurap1与Dvl在调节CE运动中具有物理和功能上的相互作用

2．3．Lurap1调节Dvl的细胞膜定位

2．4．高表达Lurap1影响CE运动

2．5．Lurap1负调节JNK的激活

3．结论和讨论

参考文献

第四部分 材料和方法

3．斑马鱼DNA的提取

4．分子克隆相关方法

4．1．斑马鱼胚胎总RNA的提取

4．2．逆转录合成cDNA第一链

4．3．PCR反应

4．4．PCR产物的纯化

4．5．PCR产物的连接、转化和筛选

4．6．菌落PCR检测

4．7．质粒提取

4．8．酶切反应

4．9．切胶纯化

5．mRNA和探针RNA的体外合成和纯化

5．1．mRNA和探针RNA的体外合成

5．2．mRNA和探针RNA的纯化

6．利用TALENs技术构建突变体

6．1．TALENs靶点设计

6．2．利用Golden Gate组装TALENs步骤

6．3．检测TALENs有效性

6．4．突变体的获得

7．斑马鱼胚胎的整体原位杂交

7．1．胚胎的整体原位杂交步骤

7．2．用于胚胎整体原位杂交的试剂

8．斑马鱼胚胎的整体免疫组织化学

8．1．免疫组织化学步骤

8．2．样品封片及观察

8．3．实验中需要使用的抗体

8．4．用于免疫组化的试剂

9．Phalloidin和DAPI染色及激光共聚焦显微镜观察

9．1．Phalloidin和DAPI的染色方法

10．1．悬滴法检测细胞凝聚

10．2．细胞分离和重凝聚检测粘附力大小

11．2．Kaede-GFP标记细胞检测CE运动

12．斑马鱼脊索细胞的观察

13．双荧光素酶报告基因检测

14．Western blot

14．1．步骤

14．2．相关试剂

15．免疫共沉淀

参考文献

攻读学位期间完成的工作

致谢