一种硫酸软骨素E降解抗性的糖胺聚糖裂解酶的鉴定与应用

摘要

硫酸软骨素(CS)是由重复二糖单位(unit)组成的直链线性多糖。二糖单位由葡萄糖醛酸(GlcUA)与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)通过β1-3糖苷键连接而成，重复二糖单位之间通过β1-4糖苷键连接。硫酸软骨素是糖胺聚糖(GAG)的主要种类之一，常作为蛋白聚糖(proteo glycans)侧链被合成，广泛分布于细胞表面和细胞外基质中。CS参与了很多重要的生物学过程，如炎症反应，形态发生，肿瘤转移，病毒感染，神经生长和胞质分裂等。结构的差异赋予了CS不同的功能。葡萄糖醛酸在C-5差向异构酶的作用下转变为艾杜糖醛酸(IdoUA)，形成由艾杜糖醛酸(IdoUA)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)组成的二糖单位，此类重复二糖单位连接组成了硫酸皮肤素(DS)。因此CS和DS常常交替存在于一条多糖链内。葡萄糖醛酸(GlcUA)和/或艾杜糖醛酸(IdoUA)C-2，C-3位，半乳糖胺的C-4，C-6位常在硫酸基转移酶的作用下发生不同程度的硫酸化从而产生各种结构差异的CS和DS。
　　糖胺聚糖所具有的一系列重要的生物学功能使其成为重要的生物活性分子。然而，由于糖胺聚糖结构的不均一性和复杂的硫酸化模式使得不同来源甚至同一来源不同发育阶段的同种糖胺聚糖在结构和序列上存在很大差异。近年来越来越多的研究表明，糖胺聚糖结构中特定结构序列与特定蛋白相互作用赋予了糖胺聚糖的多种生物学功能。此外，同一多糖链中不同的结构序列与不同蛋白的相互作用，使得糖胺聚糖具有不同功能，因此可以通过选择性部分降解糖胺聚糖多糖链，制备结构均一或相对均一的特定功能区寡糖用于医药及功能食品的相关研究和开发。
　　含有E unit的CS在哺乳动物组织如脑，肝，脾，肾和肿瘤内均有发现，通过与生长因子和趋化因子相互结合展现出了不同的生理学和病理学特性。有趣的是，这些相互作用可以被含有E unit(GlcUAβ1-3GalNAc(4S，6S))或iE unit(IdoUAα1-3GaINAc(4S，6S))的外源性CS/DS抑制。尤其是，来自鱿鱼软骨的CS-E展现了显著的生物学活性，如促进神经发育，抑制病毒侵染和肿瘤转移等。研究发现，含有E unit的CS中富含E unit的区域在CS发挥生物活性时起着关键作用，且CS-E发挥活性的最小必需寡糖已被鉴定。与复杂的CS-E多糖相比，CS-E寡糖聚合度和结构相对均一，大大地避免了多糖在特殊生物活性中作用机理的模糊性，减少了生物学降解途径，且分子量小、带电荷少易于吸收。
　　这些研究表明，CS-E可以作为新型糖胺聚糖类药物研发的前体。因此制备结构均一或相对均一，活性确定，富含E unit的CS-E寡糖对于医药研发尤为重要。可是长期以来始终缺乏在降解过程中可以选择性保留富含E unit寡糖片段的糖胺聚糖降解酶。
　　本课题以美洲大赤鱿软骨为原料制备了新型富含E unit硫酸软骨素(CS-nE)，并对其分子量、二糖组成和生物活性做了初步的研究;以CS-nE为底物从海洋细菌Vibrio sp.FC509筛选鉴定了一个糖胺聚糖裂解酶，该酶可以有效的降解HA和CS产生二糖终产物，但是不能有效降解富含E unit的CS片段，因此我们命名此酶为CS-E抗性HA/CS裂解酶(HCLase Er)，并对HCLase Er基本酶学性质，作用模式及催化机制进行了研究。主要研究结果如下:
　　1.新型硫酸软骨素CS-nE分离纯化、结构组成及生物活性的初步分析:以美洲大赤鱿软骨为原料，经过酶解、乙醇沉淀和离子交换等技术制备了新型硫酸软骨素CS-nE。通过凝胶过滤高效液相色谱，以一系列具有不同分子量的葡聚糖为标准，绘制出分子量与洗脱时间的标准曲线，确定了CS-nE的分子量约为623.3kDa;通过商品化硫酸软骨素降解酶CSase ABC完全降解CS-nE，并结合阴离子交换HPLC分析其二糖组成，结果表明该新型硫酸软骨素主要由O、C、A、和E unit四种主要的二糖单位组成，所占摩尔百分比分别为6.9％、12.1％、35.4％、和45.6％，其中E unit含量最高，因此将该新型硫酸软骨素命名为CS-nE。在此基础上，对新型CS-nE的各种不饱和二糖进行了质谱分析，结果显示不饱和二糖的质荷比分别为378.1009(1)、458.0558(1)、538.0120(1)/268.50332(2)，与不饱和△O(△4,5HexUAα1-3GalNAc)、△A/C(△4,5HexUAα1-3GalNAc(4S/6S))、△E(△4，5HexU△α1-3GaINAc(4S，6S))的理论分子量相符。最后，通过制备CS-nE的生物传感芯片，利用BIAcore研究了CS-nE与各种生长因子和选择素的相互作用，结果表明CS-nE可以与生长因子HGF、bFGF、PTN和HB-EGF发生高亲和力相互作用，其中结合常数ka分别为:(5.67±1.84)×106，(3.26±1.19)×106，(8.14±0.31)×103，(2.36±1.56)×108M-1S-1;分离常数kd分别为:(2.01±0.46)×10-3，(6.81±0.71)×10-5，(2.43±0.73)×10-4，(9.6±1.48)×10-2S-1;平衡常数Kd分别为:0.26±0.004，0.03±0.01，27.38±7.95，0.27±0.16nM;与aFGF和VEGF165的相互作用较弱。这一结果预示着，CS-nE可以通过与各种生长因子的相互作用，在细胞信号转导中发挥调节作用，从而在各种生理和病理过程中具有重要的生物活性。此外，未发现CS-nE与选择素（SELL、SELE、SELP）存在显著的相互作用。
　　2.HCLase Er的鉴定、作用模式、催化机制的研究:利用在线数据库和生物信息学软件对HCLase Er的基因和蛋白序列进行了分析，该基因（GenBankTM编号MF458894）编码区由2973bp组成，编码的蛋白HCLase Er由990个氨基酸组成，蛋白质的理论分子量约为108.4kDa，理论等电点pI为5.34。被鉴定的蛋白中，与HCLase Er蛋白序列相似度最高的是来源于Flavobacterium heparinum的CSase ACⅠ裂解酶(34％)。通过基因工程技术将HCLase Er的编码基因成功构建到大肠杆菌表达载体pET-30a(+)上，将重组基因转到大肠杆菌DH5α扩增，然后再转到BL21(DE3)表达，对表达的重组酶进行了纯化，并对其酶学性质和作用模式进行了分析。结果显示，我们获得了纯度大于90％的重组酶;该酶的最适反应条件为:Tris-HCl，pH8.0，30℃;NaCl并不能提高HCLase Er酶活，反而高浓度NaCl(500mM)可抑制HCLase Er活性。该酶可以有效降解HA，CS-A，CS-C和CS-D产生不饱和二糖终产物，但是不能有效降解富含E unit的CS-E，因此我们命名此酶为CS-E抗性HA/CS裂解酶(CS-E-resisted HA/CS lyase，HCLase Er)。通过rHCLase Er彻底降解低硫酸化度的CS-nE制备了一系列CS-nE抗性寡糖，通过二糖组成分析发现抗性寡糖中E unit含量显著增高。对抗性四糖序列的分析，发现非还原端均为不饱和△E(△4，5HexUAα1-3GalNAc(4S，6S))，且△E-E(△4，5HexUAα1-3GalN Ac(4S，6S)β1-4GlcUAβ1-3GalNAc(4S，6S))具有最强的抗性，抗性四糖可以部分抑制HCLase Er对HA/CS-A的降解。抗性四糖△E-E经4-O-endosulfatase处理脱掉4位硫酸根后，很容易被HCLase Er降解，上述结果表明GalNAc的C-4，C-6位同时硫酸化阻止了HCLase Er对E unit和后面二糖之间β1-4键的剪切。据我们所知，这是第一个被鉴定的不能有效降解CS-E的糖胺聚糖裂解酶。利用点突变方法将四个保守氨基酸分别突变为丙氨酸(Ala)，结果显示，rHCLase Er-H243A、rHCLase Er-Y252A、rHCLase Er-R306A和rHCLaseEr-R310A四个突变蛋白均失去了降解HA及CS的活性，揭示HCLase Er可能采取酸碱催化机制降解底物;删除蛋白区域（Gly739-Gln796）导致HCLase Er失活，说明蛋白区域（Gly739-Gln796）是酶发挥活性必不可少的结构域。本课题为糖胺聚糖结构功能分析和制备HA/CS活性寡糖，尤其CS-E活性寡糖提供了有效的工具酶。
　　3.HCLase Er的应用:重组HCLase Er在最适条件下(Tris-HCl，pH8.0，30℃)部分降解CS-nE多糖，经过乙醇沉淀后，利用凝胶过滤高效液相色谱分离制备了系列聚合度均一的富含E unit的寡糖。通过商品化硫酸软骨素降解酶CSase ABC完全降解不同聚合度的CS-nE寡糖，并结合阴离子交换HPLC分析其二糖组成，结果表明CS-nE寡糖中E unit含量明显提高，是最主要的二糖单位。将4T1小鼠乳腺癌细胞通过尾静脉注射到6-8周龄BALB/c雌性小鼠建立实验肿瘤转移模型。结果显示CS-nE六糖、八糖、十糖、十二糖及其多糖的抑瘤率分别为45.84％、31.95％、77.78％、72.12％、64.85％，表明CS-nE十糖和十二糖具有显著地抗肿瘤转移效果，CS-nE六糖和八糖具有一定的抗肿瘤活性，其中CS-nE十糖抗肿瘤效果最佳。

目录

声明

摘要

符号说明

1．1．1 糖胺聚糖(GAG)

1．1．2 糖胺聚糖的分类

1．2 硫酸软骨素

1．2．1 硫酸软骨素的结构和分类

1．2．2 硫酸软骨素生物学功能

1．3 硫酸软骨素降解酶(Chondroitinase，CSase)

1．3．1 硫酸软骨素降解酶ABC(Chondroitinase ABC，CSase ABC)

1．3．2 硫酸软骨素降解酶AC(Chondroitinase AC，CSase AC)

1．3．3 硫酸软骨素降解酶B(Chondroitinase B，CSase B)

1．3．4 降解硫酸软骨素的透明质酸酶

1．3．5 新型硫酸软骨素降解酶研究现

1．4 选题意义

第二章 新型硫酸软骨素E(CS-nE)的提取和鉴定

2．1 实验材料

2．1．1 材料

2．1．2 试剂

2．1．3 仪器设备

2．2 实验方法

2．2．2 CS-nE的分级纯化

2．2．3 CS-nE的分子量分析

2．2．5 CS-nE二糖组成的质谱分析

2．2．6 生物芯片的制备

2．2．7 CS-nE与蛋白的相互作用分析

2．3 实验结果与分析

2．3．2 CS-nE(Fr2M)的二糖组成

2．3．4 CS-nE(Fr2M)与生长因子和选择素的相互作用

2．4 本章小结

第三章 CS-E抗性糖胺聚糖裂解酶(HCLase Er)的鉴定与表达

3．1 实验材料

3．1．1 菌株与质粒

3．1．2 主要实验试剂

3．1．3 主要仪器与设备

3．1．4 软件工具和数据库

3．2 实验方法

3．2．1 HCLase Er基因和蛋白的序列分析

3．2．2 重组HCLase Er表达质粒的构建

3．2．3 重组HCLase Er蛋白的异源表达和纯化

3．3 实验结果

3．3．1 HCLase Er基因及蛋白序列

3．3．2 HCLase Er表达质粒的构建

3．3．3 重组HCLase Er的表达与纯化

3．4 本章小结

第四章 糖胺聚糖裂解酶HCLase Er的基本酶学性质和作用模式

4．1 实验材料

4．1．1 菌株与质粒

4．1．2 试剂

4．1．3 仪器与设备

4．2 实验方法

4．2．1 HCLase Er的底物特异性分析

4．2．2 HCLase Er的基本酶学性质分析

4．2．3 HCLase Er的酶活测定

4．2．4 HCLase Er内／外切活性分析

4．2．5 HCLase Er终产物的HPLC分析

4．2．6 HCLase Er终产物的质谱分析

4．2．7 HCLase Er降解高硫酸化度的商品化CS-E分析

4．2．8 HCLase Er降解CS-nE的分析

4．2．9 CS-nE寡糖的制备及其二糖组成分析

4．2．10 HCLase Er抗性四糖的酶解测序

4．2．11 HCLase Er抗性四糖的质谱分析

4．2．12 抗性四糖对HCLase Er酶活的影响

4．2．13 4-O-endosulfatase预处理抗性四糖对HCLase Er降解作用的影响

4．2．14 HCLase Er定点突变或冗余序列删除对酶活的影响

4．3 结果与分析

4．3．1 HCLase Er的底物特异性

4．3．2 HCLase Er的基本酶学性质

4．3．3 HCLase Er内切特征

4．3．4 HCLase Er降解HA／CS的终产物分析

4．3．5 HCLase Er难以降解高硫酸化度的商品化CS-E

4．3．6 HCLase Er降解CS-nE的时间过程分析

4．3．7 HCLase Er抗性寡糖的二糖组成特征

4．3．8 HCLase Er抗性四糖序列和质谱分析

4．3．9 抗性四糖部分抑制了HCLase Er对HA和CS-A的降解

4．3．10 4-O-endosulfatase预处理促进了HCLase Er对抗性四糖的降解

4．3．11 HCLase Er突变及其对活性的影响

4．4 本章小结

第五章 重纽HCLase Er的应用

5．1 实验材料

5．1．1 试剂

5．1．2 仪器设备

5．2 实验方法

5．2．2 聚合度均一CS-nE寡糖的大量制备

5．2．4 CS-nE寡糖抗肿瘤细胞转移活性的分析

5．3 实验结果

5．3．1 不同聚合度CS-nE寡糖的分析

5．3．2 CS-nE寡糖的二糖组成分析

5．3．3 CS-nE寡糖的抗肿瘤转移活性分析

5．4 本章小结

全文总结与展望

参考文献

致谢

攻读博士学位期间参与的项目

博士期间发表论文及申请专利