肿瘤抑制轴MicroRNA-141-3p/GP73通过调节上皮-间质转化抑制肝癌细胞的生长及转移

摘要

背景:
　　肝细胞癌(HCC)是我国第四位常见恶性肿瘤，同时也是第二位肿瘤致死病因，这使得其成为全世界最六常见的恶性肿瘤。由于HCC具有较高的侵袭转移的特性及复发率高，患者预后较差。因此，寻找新的HCC治疗靶点具有重要意义。近来研究表明，GP73在HCC的发生发展过程中是一种促癌性调控因素，其过表达可促进HCC细胞的生长、侵袭及迁移。此外，MicroRNAs(miRNAs)靶向调节下游基因与抑制肝癌侵袭转移密切相关。因此，miRNAs靶向调节GP73成为干预HCC侵袭转移的新策略。
　　目的:
　　1.通过收集相关研究资料客观评价中国人群的GP73表达水平与HCC侵袭性及术后转移复发的关系。
　　2.筛选到能够直接靶向调控GP73基因的hsa-miR-141-3p;
　　3.探讨HCC组织中GP73与miR-141-3p表达水平的相关性;
　　4.探讨miR-141-3p靶向调控GP73对HCC细胞增殖、侵袭及转移的影响及分子机制。
　　方法:
　　1.中国人群的GP73表达水平与HCC侵袭性及术后转移复发的关系的评估。
　　(1)采用计算机信息检索系统搜索常用权威英文数据库，包括Embase，PubMed，Web of Science及Cochrane等数据库;
　　(2)我们对包括1187例患者数据信息的8个独立研究进行了系统评价，评价指标中包含:总生存时间(overall survival，OS)、无病生存时间(disease-free survival，DFS)、血管侵犯、病理Edmondson-Steiner分级及临床TNM分期等相关的临床病理特征;
　　(3)风险比(Hazard ratios，HR)和比值比(Odds ratio，OR)及相应95％(confidence intervals，CI)的统计采用随机效应模型，并分别作为生存分析结果和临床病理参数的合并统计量。
　　2.筛选到能够直接靶向调控GP73基因的hsa-miR-141-3p。
　　(1)通过生物信息学软件(TargetScanHuman7.1、microRNA.org及MIRDB)筛选到可能直接靶向调控GP73基因的hsa-miR-141-3p;
　　(2)Q-PCR分别检测不同HCC细胞系中hsa-miR-141-3p的表达情况;
　　(3)双荧光素酶报告基因实验验证hsa-miR-141-3p与GP73存在靶向关系。
　　3.HCC组织中GP73与miR-141-3p表达水平的相关性。
　　(1)Q-PCR及Western Blot对癌及癌旁组织中的hsa-miR-141-3p与GP73表达水平分别进行了检测;
　　(2)进行皮尔逊相关系数及与相关临床病理特征及参数相关性的分析。
　　4.miR-141-3p靶向调控GP73对HCC细胞增殖、侵袭及转移的影响及分子机制。
　　(1)MTT、EdU及克隆形成实验，Transwell、细胞划痕愈合实验观察miR-141-3p过表达对HCC细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响;
　　(2)Western blot检测EMT标志物分子的变化，包括E-cadherin，N-cadherin，occludin，vimentin及Cytokeratin18蛋白表达水平;
　　(3)功能恢复实验:恢复表达不含3'-UTR的GP73基因后观察miR-141-3p过表达对HCC细胞增殖、迁移/侵袭能力及EMT的影响;
　　(4)体内实验检测miR-141-3p过表达对裸鼠皮下成瘤和体内肺转移能力的影响。
　　结果:
　　1.HCC患者GP73高表达与更差的OS[HR1.958，95％CI1.548to2.368，I2=0.0％]及更差的DFS[HR1.775，95％CI1.416to2.133，I2=0.0％]相关;
　　2.HCC患者GP73高表达与肿瘤血管侵犯[OR1.286，95％CI0.618to2.679，I2=82.7％]，更晚的临床TNM分期[OR10.084，95％CI1.884to53.976，I2=93.0％]，更差的病理Edmondson-Steiner分级[OR7.912，95％CI5.492to11.399，I2=26.0％]相关;
　　3.通过生物信息学工具预测，可能直接靶向调控GP73基因的hsa-miR-141-3p;hsa-miR-141-3p在HCC细胞系中的表达水平明显低于永生化正常肝细胞系LO2;双荧光素酶报告分析表明，hsa-miR-141-3p mimic与GP73-WT-3'UTR质粒共转染可使荧光素酶活性明显下降，而hsa-miR-141-3p mimic与GP73-MT-3'UTR质粒共转染后活性无明显改变;hsa-miR-141-3p在HCC组织中的表达水平明显低于癌旁组织，GP73则相反;与临床病理特征或参数相关性分析表明，hsa-miR-141-3p低表达与与TNM临床分期、肿瘤分化及血管侵犯密切相关;
　　4.MTT、EdU、克隆形成实验及裸鼠皮下成瘤实验结果显示，过表达miR-141-3p能够显著抑制HCC细胞增殖能力、克隆形成能力及裸鼠皮下成瘤能力。Transwell、细胞划痕愈合及裸鼠体内肺转移实验结果显示，过表达miR-141-3p能够显著抑制HCC细胞侵袭、迁移及肺转移能力。功能恢复实验显示，恢复表达不含3'-UTR的GP73基因后部分逆转了miR-141-3p的抑制作用;
　　5.Western blot检测EMT相关标志物分子显示，在MHCC-97H细胞中过表达miR-141-3p后，上皮样细胞分子E-cadherin，occludin，及Cytokeratin18蛋白相对表达水平升高，而间质样细胞分子N-cadherin及Vimentin蛋白相对表达水平则下降，这提示，过表达miR-141-3p能够抑制HCC细胞的EMT过程。功能恢复实验显示，恢复表达不含3'-UTR的GP73基因后部分逆转了miR-141-3p的抑制作用。
　　结论:
　　1.GP73过表达与HCC患者肝癌切除术后预后不良相关，并对HCC侵袭、转移及复发具有预测价值;
　　2.hsa-miR-141-3p可直接靶向调控GP73基因;临床病理相关资料进一步证实，hsa-miR-141-3p在HCC组织中低表达，其表达水平与GP73mRNA表达水平呈负相关，并且与HCC侵袭、转移密切相关;
　　3.miR-141-3p作为抑癌基因，通过靶向调控GP73逆转上皮间质转化(EMT)进而抑制肝癌肿瘤的发展和转移。因此，miR-141-3p可能成为HCC治疗的新靶点。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 GP73与肝癌切除术后预后的关系一项基于中国人群的Meta分析

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二章 miR-141-3p靶向调控GP73 mRNA的表达

材料与方法

实验结果

讨论

参考文献

第三章 miR-141-3p靶向调控GP73对HCC生物学行为的影响

前言

材料与方法

实验结果

讨论

参考文献

第四章 结论

致谢

攻读学位期间发表的学术论文和参加科研情况

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