鲸类低氧耐受分子进化机制

摘要

适应性进化是在自然选择作用下，生物与环境长期相互作用的结果，阐明其遗传机制有助于揭示物种的演化历史。鲸类是哺乳动物中十分特殊的类群，它们的陆生祖先（类似偶蹄类动物）约在53-56百万年前由陆地重返海洋，通过快速辐射适应占据了世界各个水域并营完全水生生活。在生境转换过程中，鲸类面临着水下低氧所带来的巨大挑战。为了克服低氧环境，鲸类在呼吸、心血管和能量代谢等方面产生了解剖、生理生化的适应特征。与陆生哺乳动物相比，与携氧相关的血红蛋白、肌红蛋白和脑红蛋白浓度在鲸类中显著提高，增强氧气储存与运输能力。另一方面，鲸类通过有效的心血管调节保证氧气的合理利用，表现为外围血管收缩，血液重新分布，优先保证对氧气敏感的大脑和心脏等组织的血液供应，而减少皮肤、内脏、四肢等外围器官的血流量。此外，鲸类还通过降低代谢率，如通过心率过缓策略以减少缺氧对身体造成的损害。鲸类拥有比陆生哺乳动物显著提高的糖酵解酶的活性和乳酸盐浓度，可能通过厌氧代谢能力的增强补充能量合成。然而，鲸类低氧耐受的进化遗传学基础尚不清楚。鉴于此，本论文以鲸类代表性物种作为研究对象，不同生境的低氧耐受物种以及近缘的陆生哺乳动物作为对照，通过对携氧球蛋白、血管收缩相关基因以及能量代谢通路相关基因的分子进化分析，较全面解析鲸类低氧耐受分子基础和进化模式。
　　鲸类机体氧代谢过程涉及球蛋白(globin)超家族中的血红蛋白(HBA、HBB)、肌红蛋白(MB)和脑红蛋白(NGB)，分别执行血液、肌肉以及神经元中的氧运输和氧储存功能。因此，探究鲸类球蛋白基因的进化以及功能适应是解决其低氧耐受之谜的重要科学问题。本论文通过对鲸类代表性物种4个携氧球蛋白基因编码区进行扩增、测序、比较基因组学和生物信息学分析，发现HBA、HBB和MB在鲸类中受到显著正选择作用，同时鉴定到了25个受到正选择作用的氨基酸位点（HBA:9个;HBB:11个;MB:15个），表明鲸类已进化出较强的氧气储存和转运能力来抵抗低氧环境。同时，我们还发现长时间潜水的鲸类血红蛋白基因(HBB)受到的选择压力强度显著高于短时间潜水的鲸类，提示长时间潜水鲸类主要通过血红蛋白提高氧气储存能力以满足长时间潜水的需要。此外，研究结果显示栖息于不同生境的低氧耐受物种，如栖于高原的牦牛、藏羚羊以及穴居的裸鼹鼠均在血红蛋白基因(HBA，HBB)以及脑红蛋白基因(NGB)检测到显著的正选择信号，提示不同生境的低氧耐受物种均通过提高携氧能力以适应低氧环境。
　　通过外围血管的收缩，保证低氧敏感组织或器官的氧供给，是鲸类适应低氧潜水的又一有效策略。血管收缩是由血管收缩剂作用于特定的受体所引起的心血管调节反应，阐明这一适应的分子进化机制对于理解鲸类在低氧环境下心血管系统的适应性进化具有重要意义。本论文分析了13个血管收缩剂及其受体相关基因(EDN1、EDN2、EDN3、EDNRA、EDNRB、AGTR1、AGTR2、ADRA1A、ADRA1B、ADRA1D、AVP、AVPRA和AVPRB)在鲸类中的进化。结果显示AVP、ADRA1D、EDN1、EDN2、EDN3、EDNRA和EDNRB基因均在鲸类谱系中检测到显著的正选择。在皮肤中表达的AVP基因在鲸类中检测到正选择信号，提示鲸类已经进化出较强的皮肤血管收缩能力调控皮肤血流量，减少外围器官的氧气使用。ADRA1D基因在鲸类中受到显著的正选择作用，可能与鲸类在适应低氧潜水过程中增强动脉血管收缩能力有关。内皮素及其受体基因在鲸类中受到广泛而强烈的正选择作用，可能与内皮素的基础血管收缩以及控制肾脏血流量和肾脏中水钠重吸收功能相关，有利于鲸类低氧潜水时减少肾脏血流量和暂停肾过滤功能，以此减少外围器官氧气利用。值得注意的是，血管收缩基因（ADRA1D:P50A、A53G;AVPR1B:I/V270T）在潜水的鲸类、栖于高原以及穴居动物支系上检测到平行／趋同氨基酸替换位点，并且统计学分析表明这些位点的替换并非随机因素造成的，提示生活在不同生境中的低氧耐受物种所受到的选择模式相似，并通过合理的氧气使用来抵抗低氧的胁迫。
　　机体物质代谢和能量的产生均需要氧气的参与。除低氧潜水的鲸类外，高海拔环境（如牦牛、藏羚羊）、地下洞穴生活（如裸鼹鼠）或海洋生活（如海象、海牛）的哺乳类同样面临低氧环境压力。对高原物种（如藏羚羊）的研究表明能量代谢基因的适应性进化与其低氧耐受密不可分。由此可见，通过探究能量代谢基因的进化模式能够为解释哺乳动物对低氧环境的耐受机制提供重要线索。本论文根据KEGG数据库，筛选了四个与能量代谢相关的信号通路，包括糖酵解／糖异生、三羧酸循环、丙酮酸代谢和氧化磷酸化信号通路共194个基因进行分析。研究发现，鲸类中总共检测到8个受正选择的能量代谢基因，提示能量代谢基因在鲸类中经历了适应性进化。其中，6.9％的正选择基因位于三羧酸循环通路，三羧酸循环是有氧代谢的中枢环节，该通路的关键限速酶柠檬酸合酶也在鲸类中受到显著的正选择作用，该酶是衡量有氧代谢能力的指标，并在海洋哺乳动物中具有较高的活性，由此推测，鲸类在适应潜水低氧过程中，有氧代谢能力得到了提高。此外，我们在44个基因中检测到55个鲸类特异的氨基酸位点，大部分位点都发生了激进的氨基酸变化，这也是适应性进化的结果。值得注意的是，6个具有鲸类特异氨基酸位点的基因(GPI、FBP1、PCK1、PC、LDHA、LDHB)位于糖异生信号通路，如乳酸脱氢酶LDHA，在鲸类中为谷氨酰胺Q，在其他陆生哺乳动物中为谷氨酸E，功能实验进一步证实鲸类特异位点的改变可能与鲸类乳酸代谢能力的提高有关，有助于长时间潜水后肌肉中乳酸的排出，使其免受乳酸中毒的侵害。有趣的是，我们在栖息于不同生境中的低氧耐受物种中检测到不同的正选择基因，并且具有枝特异性正选择基因;例如，受正选择的线粒体基因(ATP8、ND5)只在裸鼢鼠中检测到，而未出现在其他低氧耐受物种中。此外，栖于不同低氧环境的物种正选择基因的分布也存在差异，例如:海洋哺乳动物正选择基因主要位于三羧酸循环通路，而高原、穴居类则集中于氧化磷酸化通路，这一差异可能是由于海洋哺乳动物是由于憋气潜水导致机体内部氧气的匮乏，是急性低氧(acute hypoxia);而对于高原、穴居动物而言，是由于环境中氧分压降低，氧气稀薄所致的慢性低氧(chronic hypoxia)。以上结果提示，各低氧耐受物种可能由于起源以及生境的不同，在适应各自的低氧环境过程中，能量代谢相关基因呈现了不同的、独立的进化格局。此外，我们进一步检测不同生境的物种为了适应低氧环境其能量代谢相关基因是否产生分子趋同，结果发现在29个基因检测到38个平行／趋同氨基酸位点特异地存在于低氧耐受物种中，并且69％的位点发生了激进的氨基酸突变，其中6个位点位于正选择基因上。然而，不同生境的低氧耐受物种在系统发育树上相距甚远，因此，推测为了适应低氧环境，低氧耐受物种能量代谢基因在分子水平上呈现了趋同进化。
　　尽管鲸类在长期低氧潜水环境压力下，能量代谢相关的氧化磷酸化信号通路(OXPHOS)已经发生了相应的适应性改变，但该通路网络结构对基因进化的影响机制仍知之甚少。因此，我们在KEGG数据库中筛选了97个OXPHOS基因，包括复合体1:NADH—Q还原酶、复合体2:琥珀酸—Q还原酶、复合体3:细胞色素还原酶、复合体4:细胞色素氧化酶以及ATP合成酶。通过分析蛋白网络拓扑参数，即蛋白位置(pathway position)、蛋白相互作用(PPI)、蛋白长度(protein length)以及密码子偏好性(ENC)与信号通路基因进化速率之间的相关性，结果显示，纯化选择的强度与蛋白在信号通路中的位置呈负相关，表明氧化磷酸化下游基因受到更强烈的纯化选择作用。ATP合酶位于信号通路下游，不仅负责合成ATP，而且具有水解ATP形成质子势的功能，因此信号通路下游ATP合酶受到选择约束可能与其双重功能相关。此外，密码子使用偏好性与进化速率之间呈正相关，而与同义替换速率（以）之间呈负相关，提示具有较低密码子使用偏好的基因受到强烈的选择约束可能是由于ds的增加引起的。与前人研究不同的是，本研究并未发现PPI与进化参数之间存在任何相关性，这可能是鲸类氧化磷酸化信号通路在低氧环境中的独特适应。氧化磷酸化信号通路基因分子进化分析表明，15个基因在鲸类中检测到显著的正选择信号，且与陆生哺乳动物相比，5个基因是鲸类特异的正选择基因（ATP5J、LHPP、PPA1、UQCRC1和UQCRQ）。其中，UQCRC1和UQCRQ基因属于复合物Ⅲ，其功能有利于维持低氧诱导因子的稳定性，这两个基因显著受正选择，可能与鲸类维持低氧环境中能量代谢有关。值得注意的是，正选择基因PPA1具有鲸类特异氨基酸位点（Gly105Arg），提示鲸类在低氧适应过程中通过提高无机焦磷酸水平来增强能量代谢。
　　本研究以呼吸系统、心血管系统以及能量代谢等鲸类低氧潜水生理适应特征为基础，系统地探究了与这些生理适应相关的基因、信号通路等关键基因的进化模式。研究结果全面地揭示了鲸类应对低氧潜水时产生了一系列地适应性改变的分子机制，为深入理解鲸类次生水生适应的遗传学机制奠定了基础。

目录

声明

摘要

第1章绪论

1．1鲸类的起源与进化

1．2鲸类的系统发生

1．3鲸类次生水生适应分子进化机制研究进展

1．3．1体型的进化修饰

1．3．2哺乳策略

1．3．3大脑增大

1．3．4渗透调节

1．3．5感觉系统进化

1．3．6免疫防御

1．3．7低氧耐受

2．1前言

2．2材料与方法

2．2．1鲸类样本选取

2．2．2目的基因获取

2．2．3系统发生关系重建

2．2．4分子进化分析

2．2．5氨基酸理化性质改变分析

2．2．6蛋白三维结构预测分析

2．2．7低氧耐受物种趋同进化分析

2．3结果

2．3．1携氧球蛋白基因序列

2．3．2鲸类携氧球蛋白基因的正选择

2．3．3正选择位点的蛋白功能结构联系

2．3．4具有不同潜水能力的鲸类进化模式探讨

2．3．5低氧耐受物种的趋同进化

2．4讨论

第3章鲸类血管收缩相关基因在低氧适应中的分子进化机制

3．1前言

3．2材料与方法

3．2．1血管收缩相关基因筛选

3．2．2数据集构建

3．2．3分子进化分析

3．3结果

3．3．1血管收缩相关基因的分子进化

3．3．2正选择位点在蛋白功能结构域的分布

3．3．3血管收缩基因在低氧耐受物种中的趋同进化

3．4讨论

第4章低氧耐受物种能量代谢相关基因的分子进化机制

4．1前言

4．2材料与方法

4．2．1候选基因筛选与单拷贝同源基因序列获得

4．2．2分子进化分析

4．2．3趋同进化分析

4．2．4肝脏转录组分析

4．2．5乳酸脱氢酶活性测定

4．3结果

4．3．1低氧耐受物种能量代谢相关基因的进化分析

4．3．2低氧耐受物种能量代谢相关基因在信号通路中的分布

4．3．3能量代谢相关基因在鲸类中的物种特异性进化

4．3．4低氧耐受物种趋同／平行氨基酸位点鉴定

4．4讨论

4．4．1低氧耐受物种能量代谢相关基因进化模式的差异

4．4．2从能量代谢角度揭示鲸类低氧耐受适应机制

4．4．3低氧耐受物种能量代谢基因的趋同进化

第5章鲸类氧化磷酸化信号通路网络分析与低氧适应

5．1前言

5．2材料与方法

5．2．1物种选取与同源基因数据集构建

5．2．2基因进化速率估算与选择压力检测

5．2．3 OXPHOS信号通路网络分析

5．3结果

5．3．1 OXPHOS通路纯化选择压力与通路结构分析

5．3．2 OXPHOS通路基因正选择分析

5．4讨论

5．4．1网络结构对OXPHOS通路进化的影响

5．4．2鲸类OXPHOS通路基因分子进化格局

第6章结论

附录

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢