黄颡鱼PI3Ks功能解析及其通路在胰岛素调控脂类代谢中的作用机制

摘要

磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol3-kinases，PI3K)信号通路在增殖、凋亡、存活以及代谢等细胞生物学进程中发挥着重要的作用。目前，有关PI3K家族基因的结构和功能在哺乳动物中已取得了一定的进展，但是却很少有对鱼类的PI3K家族基因进行研究。胰岛素介导的PI3K信号通路(胰岛素受体底物/磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B，IRS-PI3K-AKT)是胰岛素信号通路中的经典通路。在哺乳动物中，已有大量研究表明该信号通路调控机体的营养代谢活动，促使机体糖原、脂肪和蛋白质的合成。目前在鱼类中，有关胰岛素对脂代谢研究相对缺乏，并且很少有学者关注IRS-PI3K-AKT信号通路在鱼类脂肪代谢中作用。本论文以黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）为研究对象，研究黄颡鱼PI3K家族基因的结构和功能，并结合IRS-PI3K-AKT信号通路探讨胰岛素调控黄颡鱼肝脏脂代谢的作用机制。具体包括以下几个方面:
　　1、黄颡鱼pi3ks家族基因的分子克隆及组织表达分析
　　为了初步了解黄颡鱼pi3ks家族基因基本特征，本研究采用RACE技术从黄颡鱼中共克隆得到7个不同亚型的pi3k，它们分别是pi3kca、pi3kcb、pi3kcd、pi3kcg、pi3kc2a、pi3kc2b和pi3kc3，全长cDNA序列分别为4585bp、5881bp、4036bp、3786bp、6350bp、6030bp和3552bp，分别编码1069、1069、1044、1104、1670、1579和877个氨基酸。氨基酸结构域分析显示，7个pi3k亚型共分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3类，所有pi3k亚型均包括N端C2结构域、PIK结构域、催化结构域，并且所有保守结构域中，催化结构域相似度最高，而且都包含保守的ATP结合位点。进化分析显示7个黄颡鱼不同亚型pi3k明显的分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3类，在Ⅰ类中又明显的分成4大枝，并且pi3kcb跟pi3kcd的亲缘关系更相近，并且在进化上黄颡鱼与墨西哥脂鲤在硬骨鱼类分枝上亲缘关系较近，而与哺乳动物亲缘关系较远。
　　通过荧光实时定量PCR技术，研究了黄颡鱼不同亚型pi3k在不同组织中的基因表达水平。结果显示:不同亚型pi3k均在卵巢中表达量最高，pi3kca、pi3kcb、pi3kc2a、pi3kc2b以及pi3kc3广泛表达于不同组织。而pi3kcd和pi3kcg属于组织特异性表达，特别是在肝脏、肠道、肾脏、心脏以及鳃中表达量非常低。
　　2、黄颡鱼pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3启动子克隆及其功能研究
　　本实验以第一部分实验获得PI3K的cDNA序列为基础设计引物，利用hitail-PCR方法进行pi3k启动子区域克隆，最后共得到pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3的5'上游启动子序列长度分别为360bp、1848bp和367bp。生物信息学分析显示pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3的核心启动子区结构不一样，其中pi3kca和pi3kc2b包含CpG岛，但不存在CAAT和TATA盒。而pi3kc3包含CAAT和TATA盒，但不存在CpG岛。同时，根据MatInspector和JASPAR数据库，我们还预测到pi3kca启动子区可能存在HNF1、STAT和NF-kB转录因子结合位点;pi3kc2b启动子区存在FOXO1、PPAR-RXR、STAT、IK1、HNF6和HNF3转录因子结合位点;pi3kc3启动子区存在FOXO1和STAT转录因子结合位点。
　　为了进一步验证黄颡鱼pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3不同区域启动子的功能。我们通过构建pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3启动子缺失序列表达载体，分别瞬时转染到HepG2细胞，通过双荧光素酶活性测定，确定pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3启动子的活性区域。结果显示:pi3kca的-360/-224bp区域负调控启动子活性，而-224/+71b区域正调控启动子活性;pi3kc2b的-1848/-1522bp区域正调控启动子活性，-1522/-623bp区域不影响启动子活性，-623/-388bp负调控启动子活性，-388/-144bp正调控启动子活性，-144/+79bp区域正调控启动子活性;pi3kc3的-367/-291bp区域不影响启动子活性，而-291/+59bp区域正调控启动子活性。同时，我们还发现FOXO1抑制剂AS1842856孵育显著降低pi3kc2b和pi3kc3部分载体的启动子活性。进一步的定点突变分析和凝胶阻滞分析(electrophoretic mobility-shift assay,EMSA)证明HNF1和IK1转录因子分别能直接与pi3kca和pi3kc2b启动子结合，并负调控pi3kca和pi3kc2b启动子活性;而FOXO1转录因子能够直接与pi3kc2b和pi3kc3启动子结合，并正调控启动子活性。
　　3、黄颡鱼不同组织pi3kca启动子甲基化特征的初步研究
　　为了分析黄颡鱼不同组织中pi3kca的转录水平与其启动子的甲基化状态之间的关系。我们应用重亚硫酸盐修饰黄颡鱼不同组织的DNA，并通过BSP(bisulfite sequencing PCR)法测定黄颡鱼不同组织pi3kca启动子的甲基化水平，应用荧光定量PCR的方法检测黄颡鱼不同组织中pi3kca以及甲基转移酶（dnmts:dnmt1,dnmt3a,dnmt3b）的mRNA表达水平。结果共扩增得到pi3kca启动子和第一外显子CpG岛附近536bp序列，包含34个CpG位点。通过统计分析，发现pi3kca甲基化位点主要发生在转录起始位点(+1)附近的-71，-64，-52和+8CpG位点，并且pi3kca启动子在黄颡鱼不同组织中均处于低甲基化水平。定量PCR分析显示，pi3kca在不同组织中的mRNA表达水平和甲基化水平无明显相关性，而3种dnmts均在卵巢中表达量最高，这很可能与pi3kca启动子甲基化水平也在卵巢中最高有关。
　　4、胰岛素激活IRS-PI3K-AKT信号通路调控黄颡鱼肝脏脂代谢的机制研究
　　为了研究胰岛素对黄颡鱼肝脏脂代谢的调控机制，本研究分别结合离体肝细胞实验和活体原位注射实验来进行。首先，通过分离原代黄颡鱼肝细胞，选取(0、10nM、100nM、1000nM)四个浓度的胰岛素进行孵育肝细胞，分别在48h取样，测定的指标包括肝细胞存活率、不同亚型IRS-PI3K-AKT基因的表达、肝细胞甘油三酯(TG)的累积、脂代谢相关酶酶活与基因表达。结果显示:胰岛素有促进肝细胞TG合成的趋势，100nM胰岛素处理显著增加肝细胞TG的合成。对于不同亚型的IRS-PI3K-AKT基因表达的影响，胰岛素不同程度增加了肝细胞irs1、irs2、pi3kcb、pi3kc2a、akt1和akt2的mRNA表达水平，但不影响pi3kca、pi3kcd、pi3kcg、pi3kc2b、pi3kc3、akt3a和akt3b的mRNA表达水平。胰岛素显著促进肝细胞FAS、G6PD和6PGD酶活性的增加，但不影响CPT-Ⅰ的活性。此外，胰岛素促进fas、g6pd、6pgd和pparγ等脂代谢合成基因的表达，而降低cpt1a和pparα等脂代谢分解基因的表达。本研究表明，在黄颡鱼肝细胞中，对于不同亚型的IRS-PI3K-AKT蛋白，胰岛素很可能优先激活irs2、pi3kcb、pi3kc2a、akt1和akt2亚型。其次，胰岛素能够促进肝细胞TG的合成，但存在一定的浓度效应，其中100nM胰岛素处理组最为显著。
　　其次，为了进一步验证胰岛素是否能实际调控黄颡鱼肝脏脂代谢，比较离体与在体条件下胰岛素对黄颡鱼脂代谢影响的差异。我们通过黄颡鱼腹腔注射(0、0.01μg/g、0.1μg/g、1μg/g)四个胰岛素浓度，分别在48h取样，分析黄颡鱼肝脏脂肪的沉积、肝脏脂肪代谢相关酶酶活和基因表达水平的影响。结果显示:随着胰岛素注射浓度增加，肝脏脂肪滴沉积增加，FAS酶活性也随着增加。胰岛素促进G6PD和6PGD酶活性的增加，但不影响CPTⅠ的活性。对脂代谢基因表达的影响，胰岛素有增加fas和g6pd基因表达的趋势。0.01μg/g和0.1μg/g胰岛素处理组显著增加6pgd基因的表达。0.1μg/g胰岛素注射显著增加cpt1a的表达。胰岛注射降低pparα的表达。0.01μg/g和0.1μg/g胰岛素处理组显著增加pparγ的表达。本研究表明，无论是活体注射和离体实验，胰岛素促进黄颡鱼肝脏脂肪滴的沉积，并且伴随着FAS、6PGD、G6PD和PPARγ脂肪合成相关酶酶活增加和基因表达的上调。而胰岛素对cpt1a基因的表达的影响在离体和在体实验中呈现不同的趋势，表明胰岛素对CPTⅠ的调控可能受多种因素的影响。
　　5、PI3K和FOXO1信号通路在胰岛素调控黄颡鱼脂代谢中的作用
　　为了深入了解PI3K和FOXO1信号通路在胰岛素影响黄颡鱼脂代谢过程中的作用机制。我们探讨了离体条件下，PI3K特异性抑制剂(Wortmannin)和FOXO1特异性抑制剂(AS1842856)的添加对胰岛素诱导黄颡鱼肝细胞脂代谢的调控变化。
　　胰岛素与Wortmannin共同孵育的结果显示:与对照组相比，单独的Wortmannin孵育降低肝细胞TG的沉积，但没有影响fas、g6pd、6pgd、pparα和pparγ相关基因的表达，并且降低cpt1a基因的表达。与胰岛素处理组相比，Wortmannin提前孵育显著降低胰岛素诱导肝细胞TG的合成，并且显著降低了胰岛素诱导g6pd、6pgd和pparγ的表达，但不影响fas和cpt1a的表达。本研究再次证明胰岛素促进肝细胞脂肪合成的作用，而这一作用能够被PI3K特异性抑制剂Wortmannin阻断，表明PI3K信号通路在胰岛素影响黄颡鱼脂肪沉积过程中发挥着重要作用。
　　其次，AS1842856单独孵育结果显示:AS184285显著降低所有PI3K亚型的基因表达，并且pi3kcb和pi3kc3对AS1842856的敏感度更强。
　　胰岛素与AS1842856共同孵育的结果显示:与对照组相比，AS1842856单独处理显著降低TG的合成;与胰岛素处理组相比，AS1842856处理显著降低胰岛素诱导TG的合成。与对照组相比，单独AS1842856处理不影响fas和6pgd的基因表达水平，但降低g6pd、pparγ、pparα和cpt1a的表达水平。与胰岛素处理组相比，AS1842856提前孵育显著下降胰岛素诱导g6pd、6pgd和pparγ基因的表达。本研究表明，胰岛素促进肝细胞脂肪合成作用同样能够被FOXO1抑制剂AS1842856阻断，一方面说明FOXO1信号通路可能直接参与胰岛素调控脂肪代谢的合成作用，另一方面说明FOXO1抑制剂AS1842856很可能是通过抑制PI3K的转录水平来抑制PI3K信号通路，从而导致胰岛素利用PI3K信号通路促进肝细胞脂肪合成的作用再次被阻断。本研究表明AS1842856很可能从FOXO1和PI3K双重层面阻断胰岛素促进肝细胞脂肪合成作用。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1．2 PI3K的表达

1．3 PI3K启动子研究进展

2 鱼类胰岛素信号系统关键蛋白的研究进展

2．1 胰岛素

2．2 胰岛素受体

2．3 胰岛素受体底物

3 胰岛素对鱼类脂代谢调控的研究进展

4 本研究的目的及意义

第二章 黄颡鱼pi3k家族基因的克隆及组织表达分析

2．1 实验鱼的饲养及样品采集

2．2 实验试剂

2．3 不同亚型pi3ks基因cDNA序列的克隆

2．4 序列分析

2．5 黄颡鱼pi3ks基因的组织表达分析

2．6 统计分析

3 结果与分析

3．2 黄颡鱼不同亚型pi3ks基因分类和氨基酸序列特征

3．3 黄颡鱼不同亚型pi3ks进化分析

3．4 黄颡鱼不同亚型pi3ks的组织表达水平

4 讨论

5 小结

第三章 黄颡鱼pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3启动子克隆及其功能研究

2．1 黄颡鱼及细胞系

2．2 实验试剂

2．3 黄颡鱼pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3启动子的克隆

2．4 序列分析

2．5 pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3启动子区5｀缺失片段载体构建

2．6 细胞转染

2．7 双荧光素酶活检测

2．8 定点突变

2．9 凝胶迁移阻滞分析(EMSA)

2．10 统计分析

3 结果与分析

3．1 pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3启动子序列分析

3．2 pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3的5’缺失载体启动子活性分析

3．3 FOXO1抑制剂AS1842856对pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3启动子活性的影响

3．4 定点突变分析

3．5 EMSA分析

4 讨论

5 小结

第四章 黄颡鱼pi3kca启动子甲基化特征的初步研究

2．2 黄颡鱼的养殖

2．3 DNA和RNA提取

2．4 基因组DNA甲基化修饰

2．5 PCR硫化模板扩增和测序

2．6 pi3kca启动子甲基化程度统计分析

2．7 基因表达分析

2．8 统计分析

3 实验结果与分析

3．1 pi3kca启动子CpG岛序列

3．2 不同组织pi3kca的CpG位点甲基化程度

3．3 不同组织pi3kca的基因表达水平和甲基化水平

3．4 不同组织dnmts的基因表达

4 讨论

5 小结

第五章 胰岛素激活IRS-PI3K-AKT信号通路调控黄颡鱼脂代谢的机制研究

1．前言

2．材料和方法

2．2 实验设计

2．3 样品分析

2．4 统计分析

3．实验结果与分析

3．2 胰岛素对肝细胞不同亚型IRS-PI3K-AKT基因表达的影响

3．3 胰岛素对肝细胞脂代谢相关酶酶活的影响

3．4 胰岛素对肝细胞脂代谢相关基因表达的影响

3．5 腹腔注射胰岛素对黄颡鱼肝脏脂肪沉积的影响

3．6 腹腔注射胰岛素对黄颡鱼肝脏脂代谢相关酶酶活的影响

3．7 腹腔注射胰岛素对黄颡鱼肝脏脂代谢相关基因表达的影响

4 讨论

5 小结

第六章 PI3K和FOXO1信号通路在胰岛素调控黄颡鱼脂代谢中的作用

2．1 实验试剂

2．2 黄颡鱼肝细胞的分离

2．5 基因表达分析

2．6 统计分析

3 结果与分析

3．2 Wortmannin和AS1842856对黄颡鱼肝细胞pi3ks表达水平的影响

3．3 Wortmannin和AS1842856对胰岛素诱导肝细胞TG合成的影响

3．4 Wortmannin和AS1842856对胰岛素诱导肝细胞脂代谢相关基因表达的影响

4 讨论

5 小结

第七章 总结与展望

1 总结

2 展望

参考文献

附录

致谢