重组腺相关病毒介导的CD151基因转染促血运重建的作用及其机制的研究

摘要

研究背景和目的：
　　 血管再生性治疗已成为当前冠心病治疗基础和临床研究的热点。如能在心肌缺血发生后的恰当时间内使血管再生，形成或开放冠状动脉侧支循环，就可以挽救顿抑心肌，减轻心肌缺血，减少心肌细胞的死亡数量，从而保护心脏功能，改善病人的临床症状和预后。
　　 四跨膜蛋白超家族（transmembrane-4 superfamily，TM4SF）成员CD151能与多种整合素亚型特异性结合形成CD151-整合素复合体，是整合素信号转导的跨膜连接器，也是多种整合素信号转导的交汇点。随着整合素与血管生成方面研究的不断深入，CD151也日益受到关注。研究证实CD151参与调节细胞多种功能，包括调节细胞形态、黏附、迁移、半桥粒结构的形成，及与整合素相互作用介导血管生成等。
　　 前期研究中，我们将携带CD151基因的重组腺相关病毒转染大鼠后肢缺血模型，发现后肢微血管密度及运动耐力明显高于未转染CD151组，初步确定了CD151在体内促血管生成的作用；进一步的实验中，利用裸质粒注射的方法在心肌梗死模型大鼠心肌中转染CD151，发现CD151可明显促进梗死后心肌中微血管的生成。这一系列的实验结果表明增强CD151的表达能够促进缺血组织的血管生成。但新的研究提示仅促进微血管形成并不能改善血流灌注，血液的流通更倾向于依靠动脉血管而不是微血管。那么，通过增强CD151的表达促进缺血组织的血管生成，是否能够促进有效的血运重建并改善缺血组织器官功能以及其促血管生成的机制如何，均还需进一步研究。我们设计本课题是建立在CD151的研究成果上，观察CD151促血管生成的有效性，即是否促进了功能性的血运重建，并进一步探讨其促血管生成的机制。
　　 研究方法：
　　 1.构建pAAV-CD151、pAAV-antiCD151重组质粒及pAAV-GFP对照质粒。质粒扩增、提取，氯化铯梯度离心法纯化质粒。采用三质粒共转染法包装CD151、antiCD151和GFP重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）。
　　 2.1月龄小型猪22头，随机分为4组，分别为正常对照组4头（不予冠脉结扎和注射病毒，正常喂养），rAAV-GFP组6头（结扎冠状动脉左前降支，心肌内分10点注射1×1012 viron particles的rAAV-GFP病毒），rAAV-CD151组6头（结扎冠状动脉左前降支，心肌内分10点注射1×1012 viron particles的rAAV-CD151病毒），rAAV-antiCD151组6头（结扎冠状动脉左前降支，心肌内分10点注射1×1012 viron particles的rAAV-antiCD151病毒）。转染8周后，RT-PCR、Western blot免疫印迹和免疫组化法检测心肌中CD151的蛋白表达及mRNA水平，免疫组化法检测微血管密度和小动脉密度，左冠状脉造影评价侧支循环的建立，13N-NH3 PET 显像评价心肌灌注，超声心动图进行小型猪心脏射血分数（EF）、短轴缩短率（FS）及室壁厚度的测定，评价心功能。此外，Western blot检测FAK、PI3K、Akt、eNOS、ERK、p38MAPK等信号通路蛋白表达，亚硝酸还原酶法测定心肌组织NO含量。
　　 3.将构建含有正反义CD151基因的重组腺相关病毒转染ECV304细胞，MTT法测定细胞增殖能力，Boyden小室法测定细胞的迁移能力，将转染后的细胞种植在Matrigel上，观察其类微血管结构的形成情况。Western blot检测CD151及ERK、p38MAPK的蛋白表达。同时，进一步观察ERK、p38MAPK信号抑制剂对CD151诱导细胞增殖、迁移、类微血管形成的影响。
　　 实验结果：
　　 1.成功建立了小型猪心肌梗死模型。病毒转染8周后，心肌组织CD151 mRNA水平及蛋白表达明显高于正常对照组和rAAV-GFP组（P<0.05）；rAAV-CD151组微血管密度和小动脉密度均显著高于正常对照组和rAAV-GFP组（P<0.05）。rAAV-antiCD151组CD151mRNA水平及蛋白表达则降低，微血管密度和小动脉密度均减少（P<0.05）。冠脉造影显示rAAV-GFP组有少量的侧支血管形成，rAAV-CD151组侧支血管水平不一，0～3 级都有，而rAAV-antiCD151组几乎无侧支血管形成。13N-NH3 PET心肌灌注显示，与rAAV-GFP组相比，rAAV-CD151组血流灌注显著改善，缺损面积明显减少（P<0.05），而rAAV-antiCD151组缺血更严重、缺损面积显著变大（P<0.05）。超声心动图显示，rAAV-CD151组各项心功能参数（LVEF%、LVFS%、△ALWT和△IVST）、室壁厚度（ALWTd、IVSTd）均较rAAV-GFP组明显增高（P<0.05），而rAAV-antiCD151组小型猪心功能参数和室壁厚度显著低于rAAV-CD151组（P<0.05）。此外，Western blot结果显示，高表达的CD151促进磷酸化FAK、PI3K、磷酸化Akt、磷酸化eNOS、磷酸化ERK的蛋白表达，心肌组织NO含量也明显增加。
　　 2.高表达的CD151能够促进ECV304细胞的增殖、迁移和类微血管结构形成，高表达的CD151能够上调磷酸化ERK的表达，对磷酸化p38MAPK的蛋白表达影响则不大。ERK抑制剂（PD098059）能显著减弱CD151诱导的ECV304细胞的增殖、迁移和类微血管结构的形成，但p38 MAPK抑制剂（SB203580）则对CD151诱导的ECV304细胞的增殖、迁移和类微血管结构的形成无显著影响。
　　 实验结论：
　　 1.高表达的CD151能促进缺血心肌微血管和小动脉的生成、促进侧支循环的建立、增加缺血心肌的血流灌注、明显改善心功能。
　　 2.高表达的CD151能促进FAK、PI3K/Akt/eNOS通路、ERK通路的激活。其促血管生成的机制可能与上述通路的激活有关。
　　 3.高表达的CD151能够促进ECV304细胞的增殖、迁移和类微血管结构形成。其作用与ERK通路的激活有关。