miR-107和Shh调控大鼠脑梗塞后血管新生以及血管新生成熟的机制研究

摘要

[目的]阐明 miR-107信号途径在脑梗死后促进血管新生的作用和特点，筛选验证miR-107直接靶点以及下游调控通路，探讨miR-107调控血管内皮生长因子(VEGF)从而促进血管新生的分子学机制。揭示Shh信号与VEGF、血管生成素-1（Ang-1）和Ang-2的相关性，研究Sonic Hedgehog（Shh）信号协同调控VEGF、Ang-1和Ang-2的分子机制。明确脑梗死后，miR-107对血管新生的调控作用，以及Shh信号通路对新生血管成熟的作用，为脑梗死治疗中血管新生和重建的靶向治疗提供理论依据。
　　[方法]本研究包括体内、体外两部分。体内：建立大鼠大脑中动脉梗塞模型（MCAO），并分为未处理的组（对照组），假手术组及给药组。体外：培养脑微血管内皮细胞
　　（RBMECs）、人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和神经胶质细胞（astrocytes），并在糖氧剥夺模型（OGD）条件下进行机制研究。
　　①分别在体内、体外采用免疫荧光、Western Blo t、RT-PCR观察miR-107表达水平、Shh-VEGF/Ang-1/Ang-2表达水平，分析 Shh信号与VEGF、Ang-1和Ang-2表达水平的相关性，观察VEGF、Ang-1和Ang-2在糖氧剥夺条件下的时间变化规律。②采用划痕实验、Transwell、BD基质胶管腔形成观察miR-107对RBMECs和HUVECs的迁移及管腔形成的作用。③应用基因芯片、miRanda，RNAhybrid和Tar-getScan三大基因库比对，双荧光素酶实验筛选验证miR-107下游靶基因。④体内经侧脑室注射Agomir-107、AntagomiR-107；体外构建慢病毒，稳定转染干预调控miR-107表达，观察对血管新生数目，以及下游靶基因Dicer-1、下游信号通路VEGF的调控。⑤星形胶质细胞外源性给予Shh类似物或Shh抑制剂5EI/环王巴明，采用Western Blot、RT-PCR验证 VEGF、Ang-1和Ang-2表达水平时间上的变化。⑥构建慢病毒，稳定转染星形胶质细胞上调或者下调Gli-1或NR2F2，探讨Shh同步调控VEGF、Ang-1和Ang-2的分子机制。
　　[结果]
　　1.大鼠MCAO后3-7d，miR-107表达水平升高，侧脑室注射外源性抑制miR-107表达发现血管新生数目明显减少。
　　2.上调或者下调脑微血管内皮细胞（RBMECs）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中miR-107水平，可显著提高或降低内皮瞎报迁移和进管腔形成能力。
　　3.糖氧剥夺（OGD）模型下，上调内皮细胞miR-107表达可显著提高其VEGF165(4)蛋白和mRNA表达水，但miR-107调控星形胶质细胞中VEGF165(4)表达不明显。
　　4.通过基因芯片筛选出96个miR-107下游靶基因，其中双荧光素酶证实Dicer-1为miR-107直接靶点。阻断Dicer-1后，OGD条件下降低内皮细胞中miR-107表达，miR-107不能引起VEGF165(4)表达水平的变化。
　　5.大鼠MCAO后侧脑室给予miR-107可明显增加血管数目，减少梗塞体积、miR-107或可作为血管新生的治疗靶点。
　　6.糖氧剥夺（OGD）模型下，星形胶质细胞VEGF、Ang-2表达水平明显升高，Ang-1表达水平无明显变化,三者表达水平在时间轴上不同步。
　　7.外源性给予Shh可在1h内提高星形胶质细胞中VEGF、Ang和Ang-2表达水平，并且与VE GF表达水平升高的时间点相一致。
　　8.星形胶质细胞中下调NR2F2信号分子，则可阻断Shh对VEGF/Ang-1/Ang-2调控作用，而阻断经典的Gli-1信号途径，发现Shh对VEGF/Ang-1/Ang-2调控作用未受影响。
　　[结论]
　　①大鼠MCAO后，miR-107作为促进血管新生的重要信号分子，可通过直接结合Dicer-1提高内皮细胞源性VEGF165(4)表达水平，提高 RBMECs和HUVECs的迁移能力，促进血管新生，从而显著减少脑梗塞体积。②在血管新生的基础上，S hh可通过非经典信号途径NR2F2，调控VEGF、Ang-1、Ang-2表达水平同步提高，促使新生血管成熟。对以上两方面分子机制的深入研究，期望为脑梗塞后血管新生作为治疗靶点提供依据。
　　[创新与不足]
　　创新之处：
　　1.将调控 mic roRN A作为促进血管新生的新靶点，探索促进脑卒中后脑血流灌的新策略。探套miR-107对RBMECs和HUVECs迁移能力及管腔形成的影响，发现miR-107调控血管新生的作用。
　　2.采用基因芯片（ge ne c hip）实验筛选miR-107的下游靶基因，并通过双荧光素酶验证Dicer-1为miR-107下游直接靶基因。
　　3.证实miR-107通过直接结合Dicer-1调控VEGF164，促进血管新生的分子机制。明确脑梗死后miR-107对受损脑组织的保护作用，以及外源性给予miR-107促进脑梗塞大鼠神经功能评分恢复的作用，为治疗脑梗死提供新靶点和新思路，具有重要的临床价值和广阔的发展前景。
　　4.探索脑缺血后 Shh与传统血管生成因子家族 VEGF和Angs的相关性，通过比较 Shh信号与 VEGF和Angs促进血管新生的各自特点，采用基因沉默的方法，明确 VEGF和Angs是否为 Shh的下游，阐明 Shh可能是促进脑梗塞后血管成熟的更加理想的信号途径。
　　不足之处：
　　在探讨Shh协同调控VEGF、Ang-2和Ang-1部分虽深入探讨了分子调控机制，但未在动物体内验证脑梗死后Shh对新生血管成熟的促进作用以及梗塞面积的保护作用，此部分有待进一步研究。

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绪论

第一部分miR-107通过Dicer-1调控VEGF164促进血管新生。

前言

一、材料与方法

结果

三 讨论

第二部分 Shh 通过非经典途径NR2F 2协同调控VEGF、Ang-1和Ang-2促进血管新生成熟。

前言

一 材料与方法

结果

三 讨论

综述: 血管新生与临床应用

参考文献

致谢

博士期间发表文章：