神经病理性疼痛大鼠脊髓背角谷氨酸转运体表达变化及肉毒杆菌毒素A作用机制研究

摘要

第一部分神经病理性疼痛大鼠脊髓背角GLAST、GLT-1表达变化及肉毒杆菌毒素A的有效性
　　目的：观察神经病理性疼痛(NP)大鼠脊髓背角谷氨酸转运体-1（GLAST）及谷氨酸转运体-2（GLT-1）表达变化，观察星型胶质细胞GLAST和GLT-1的分布情况，检测不同浓度肉毒杆菌毒素A(BTXA)的镇痛有效性及安全性。
　　方法：选取120只雄性SD大鼠（150 g~180 g）随机分为7组，实验一包括2组分别是假手术组(sham组，n=30)，手术组(PSNL组，n=60)，PSNL组大鼠行右侧部分坐骨神经结扎，sham组大鼠仅暴露并分离右侧坐骨神经。实验二建立PSNL模型后随机分为5组分别是BTXA5组(n=6)，BTXA10组(n=6)，BTXA20组(n=6)，BTXA40组(n=6)，vehicle组(n=6)。BTXA5、BTXA10、BTXA20、BTXA40组分别为术侧足底皮下注射浓度5U/kg、10U/kg、20U/kg、40U/kg的肉毒杆菌毒素A，vehicle组单纯注射溶剂。采取共聚焦免疫荧光检测实验一中脊髓背角GLAST及GLT-1表达变化，双重免疫荧光标记星型胶质细胞GLAST和GLT-1共表达情况，免疫印迹法（Western-blot）进行GLAST、GLT-1定量。各组大鼠术前1天（基础值）和术后1，3，5，7，14天均进行机械痛阈（PWT）和热痛阈（PWL）测定。
　　结果：PSNL组术后第3天术侧机械痛阈（PWT）及热痛阈（PWL）明显下降，且均持续至第14天，与sham组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。sham组大鼠PWT和PWL与术前相比未见明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。Western blot结果显示PSNL组GLAST术后3天表达增加伴随少量表达持续至14天（P＜0.05）；GLT-1术后5天表达增加至10天后明显下降（P＜0.05）。sham组GLAST及GLT-1表达无变化。双重免疫荧光结果显示星型胶质细胞表达GLT-1但未见GLAST表达。BTXA5、BTXA10、BTXA20组机械痛阈（PWT）及热痛阈（PWL）明显提高，与vehicle组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。BTXA40组大鼠于注射药物后第2天全部死亡。
　　结论：PSNL大鼠星型胶质细胞主要表达GLT-1，星型胶质细胞可能由于GLT-1下调诱导活化参与NP的发展。术侧足底皮下注射肉毒杆菌毒素A（5-20 U/kg）均具有良好的镇痛作用，且BTXA10组PWT和PWL测定数值稳定性最好，但足底皮下注射40 U/kg肉毒杆菌毒素A可致大鼠死亡。
　　第二部分肉毒杆菌毒素A上调GLT-1发挥抗神经病理性疼痛作用
　　目的：研究BTXA对神经病理性疼痛大鼠脊髓背角GLT-1表达的影响。
　　方法：选取90只雄性SD大鼠（150 g~180 g）建立PSNL模型后随机分为三组(n=30)：A组(vehicle组)，B组（单次术侧足底皮下注射BTXA），C组（单次术侧足底皮下注射BTXA+腹腔注射GLT-1抑制剂），其中C组GLT-1抑制剂腹腔注射每天一次，直至第6天停止注射。测定各组大鼠术前1天（基础值）和术后1，3，5，7，14天机械痛阈（PWT）和热痛阈（PWL）。每组大鼠于术后不同时间点随机取6只处死，采取共聚焦免疫荧光检测大鼠右侧腰5脊髓背角GLT-1表达变化，免疫印迹法（Western-blot）进行相应脊髓节段GLT-1定量。
　　结果：B组PWT和PWL明显升高，与A组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。 C组PWT和PWL于术后3天明显下降并维持至第6天，与B组同时期比较差异有统计学意义（P＜0.05），但7天后PWT和PWL开始上升与B组同时期比较差异无统计学意义(P>0.05)。B组GLT-1表达3天开始上调，第7天达高峰并持续表达至14天，与A组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。与B组比较，C组术后3天GLT-1表达明显减少并持续至第6天（P＜0.05），但7天后GLT-1表达开始逐渐增加(P>0.05)。
　　结论：单次足底皮下注射BTXA可逆转大鼠神经病理性疼痛，且持续作用时间至14天。腹腔注射GLT-1抑制剂能反转BTXA的镇痛作用，但停止腹腔注射GLT-1抑制剂后痛阈逐步上升。肉毒杆菌毒素A通过上调GLT-1发挥抗NP作用。