MiR-138与SIRT1之间的相互拮抗关系以及这种关系在血管生成中的作用

摘要

本研究分为三部分：
　　第一部分：建立内皮细胞的衰老模型，并探讨 microRNA-138在这一模型中所起的作用
　　目的：通过建立细胞衰老模型来研究内皮细胞在长期培养过程中细胞增殖能力的变化方式以及microRNA-138表达水平的变化方式，并探讨microRNA-138在这一过程中作用。
　　方法：人脐静脉内皮细胞（HUVEC）连续4周每周以1:3的方式进行传代培养，并将1-4周中每一周的细胞命名为P1、P2、P3和 P4。每一代的细胞在固定的时间点（0、24、48和72 h)）检测细胞的增殖能力。通过RT-PCR实验检测每一代细胞microRNA-138的表达量。通过β-半乳糖苷酶染色检测microRNA-138对内皮细胞衰老程度的影响。通过CFSE实验以及PI实验检测microRNA-138对内细胞增殖能力的影响并研究具体的影响机制。
　　结果：人脐静脉内皮细胞的增殖能力随着培养时间的延长而逐渐下降。通过RT-PCR实验发现microRNA-138在人脐静脉内皮细胞内稳定表达，其含量随着内皮细胞培养时间的延长而逐渐增加，在P1代细胞中的表达量最低而在P4代细胞中的表达量最高。在细胞衰老实验中可以看到microRNA-138可以显著促进内皮细胞衰老。MicroRNA-138可以明显抑制人脐静脉内皮细胞的增殖。MicroRNA-138可以将G2/M期的细胞从29％降到11.84%，将G1/G0期的细胞从55.99%上升到75.83%。
　　结论：在长期培养的过程中，内皮细胞逐渐衰老，增殖能力逐渐下降，与此同时，microRNA-138的表达水平逐渐上升。MicroRNA-138可以促进细胞衰老并通过改变细胞周期的方式抑制内皮细胞的增殖。
　　第二部分：通过体内体外成血管功能实验证实microRNA-138能够抑制血管内皮细胞的成血管能力
　　目的：之前的研究证实microRNA-138能够抑制血管内皮细胞的增殖。本研究通过各种体内、体外功能实验探讨microRNA-138对血管内皮细胞成血管功能的影响。
　　方法：通过迁移实验、成血管实验、成球实验研究等体外实验研究microRNA-138对血管内皮细胞成血管能力的影响。通过基质胶塞实验以及视网膜成血管实验等体内实验研究microRNA-138能否对体内的成血管过程产生影响。
　　结果：在体外实验中，我们发现microRNA-138能够抑制内皮细胞额迁移能力，减少管腔样结构在基质胶上形成并能够抑制三维内皮细胞球的芽生能力。在基质胶塞实验中，我们看到microRNA-138能够抑制能够拮抗VEGF的诱导成血管作用。在视网膜成血管实验中，microRNA-138能够抑制新生小鼠的视网膜内出生后的血管生成。结论：在体内和体外的成管功能实验中，microRNA-138能够抑制内皮细胞的血管生成能力。
　　结论：在体内和体外的成管功能实验中，microRNA-138能够抑制内皮细胞的血管生成能力。
　　第三部分：探讨microRNA-138抑制血管内皮细胞成血管能力的内在机制
　　目的：之前的研究证实，microRNA-138能够抑制内皮细胞的血管生成能力，但具体的机制并不明了，本部分研究探讨microRNA-138调控血管生成的具体机制。
　　方法：通过生物信息学算法寻找microRNA-138的下游靶基因，通过双荧光素酶实验探讨microRNA-138对下游靶基因的调控方式，通过WB实验以及PCR实验检测在内皮细胞中microRNA-138是否能对靶基因进行调控。通过回复实验验证microRNA-138调控血管生成的过程是通过下游靶基因完成的。
　　结果：SIRT1是microRNA-138的下游靶基因，该基因的mRNA3’UTR区与microRNA-138互补配对，双荧光素酶实验证实microRNA-138可以通过SIRT1 mRNA3’UTR调控SIRT1的表达。在内皮细胞中，过表达microRNA-138能够下调SIRT1 mRNA水平以及蛋白水平。过表达SIRT1能够逆转microRNA-138对内皮细胞成血管能力的抑制作用
　　结论：MicroRNA-138通过下调SIRT1的表达调控内皮细胞的血管生成能力。

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封面

声明

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第一部分 建立内皮细胞的衰老模型，并探讨 microRNA-138 在这一模型中所起的作用

摘要

Abstracts

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 通过体内体外成血管功能实验证实microRNA-138能够抑制血管内皮细胞的成血管能力

摘要

Abstract

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 探讨microRNA-138抑制血管内皮细胞成血管能力的内在机制

摘要

Abstract

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

综述: 非编码RNA的种类以及功能回顾

附录一 英文缩略词表及中文对照

附录二 攻读博士学位期间主要发表的论文

致谢