RY10-4逆转乳腺癌多药耐药性及其抗肺腺癌活性研究

摘要

黄酮(flavonoids)大量存在于我们的饮食中，有着优良的药理、保健活性于一体的多种功效。它是一种在草本植物当中广泛存在的化合物，对人类的身体健康起着重要的维系作用。黄酮类化合物不仅可以从基本的日常生活中去调节身体机能的基本状态，还可以预防肿瘤以及心血管等重大疾病。近年来随着科学水平的深入研究，在临床治病的角度上来看，有一些黄酮有着纯天然且几乎无毒性等特点而广受人们的青睐。
　　普通针毛蕨主要生长在我国长江以南的位置，是一种金星蕨科针毛蕨属植物。民间古方中普遍认为该种草本植物在清热解毒，散结软坚方面具有独特的功效，因此在传统祖国中医学里，它常常被用来做消除水肿及治疗止血之用。这种植物当中含有一种特殊的黄酮成分叫做原芹菜素（Protoapigenone）。它在体内外的抗癌活性细胞筛选中均有很好的抗瘤表现。Protoapigenone对很多不同来源的癌症细胞都能够表现出很明显的细胞毒作用，因此抗肿瘤谱较为全面，这让广大科研工作者为之欣喜。在后续科学研究中发现，一系列的非芳香 B环的黄酮类化合物例如原芹菜素都有着强大的抗瘤活性。原芹菜素近几年在多药耐药方面也表现出不俗的成绩，可以有效的治疗和逆转肿瘤细胞多药耐药。
　　根据构效关系研究及相关文献的报道，结合前人对 Protoapigenone的研究基础，采用化学全合成的方法合成了毒性更低，药效更强，含1-hydroxycyclohexa-2,5-dien-4-one基团的新型化合物 RY10-4，其化学名为2-(1-hydroxy-4-oxo-2,5-cyclohexadien-1-yl)-4H-Pyran-4-one。本课题主要对RY10-4的药效活性进行了深入研究，主要内容包括两个部分：第一部分主要进行了RY10-4体内和体外逆转多药耐药性的乳腺癌的作用及其所涉及影响的相关信号传递通路；第二部分主要研究了 RY10-4体外抑制人肺腺癌A549细胞增殖、侵袭以及诱导凋亡的作用，并对其抗肺癌活性相关的作用机制进行了研究。
　　第一部分：RY10-4体内外对多药耐药乳腺癌的杀伤及逆转作用研究
　　目的：本实验在前期工作中证实RY10-4在体外可以诱导乳腺癌细胞MCF-7的凋亡，同时我们在对 RY10-4的一个初步预实验中发现，RY10-4作为原芹菜素类似物能逆转阿霉素（Adriamycin, ADR）激活的p-AKT，提示其可能和原芹菜素一样对阿霉素耐药的肿瘤细胞也发挥抗肿瘤作用，在临床运用上可能具有潜在意义，但RY10-4是否真正具有逆转耐药作用及可能的作用机制尚不清楚，因此本部分对此进行着重探讨。首先，研究 RY10-4在体外水平对乳腺癌多药耐药细胞MCF-7/ADR生长增殖的影响；其次，进一步研究RY10-4对化疗药物ADR运用于MCF-7/ADR细胞的敏感性及其对药物转运相关功能的改变；然后，我们更进一步探讨了RY10-4在逆转MCF-7/ADR多药耐药时所涉及的相关信号传导通路；最后，在体内水平研究了RY10-4对耐药型乳腺癌的抗肿瘤效应及逆转作用。
　　方法：本实验采用了乳腺癌敏感细胞系MCF-7和对阿霉素耐药的多药耐药细胞系MCF-7/ADR，观察 RY10-4体内和体外抗癌和逆转耐药的作用。（1）采用四氮唑盐还原法（MTT法）绘制细胞生长曲线，观察RY10-4对MCF-7和MCF-7/ADR细胞生长的影响；采用Annexin V/PI染色法，流式细胞术检测RY10-4对细胞MCF-7和MCF-7/ADR凋亡状态的改变和影响。（2）采用MTT法体外检测RY10-4对药物ADR敏感性的分析，探究细胞MCF-7/ADR在RY10-4作用下对ADR药物敏感程度的影响。（3）采用罗丹明（Rhodamine）外排实验检测MCF-7和MCF-7/ADR细胞膜在RY10-4作用下的药物转运泵功能的影响；运用Western Blot实验技术检测 MCF-7/ADR细胞在 RY10-4作用下细胞内 P-gp蛋白表达水平的改变；运用Real-time PCR技术检测RY10-4作用后细胞MCF-7/ADR内多药耐药基因MDR1的转录水平的改变。（4）通过ATP水平检测实验，研究RY10-4对MCF-7/ADR细胞中过量表达的P-gp的影响。（5）通过Western Blot和Real-time PCR等实验方法检测RY10-4对MCF-7/ADR细胞内Akt，p-Akt，NF-κB蛋白表达的影响，进一步联合使用Akt抑制剂LY294002和NF-κB抑制剂PDTC检测对MDR1基因和P-gp蛋白的影响。（6）运用移植瘤模型研究RY10-4体内逆转阿霉素的作用并用HE染色研究肿瘤组织的病理学改变。
　　结果：RY10-4具有很强的逆转乳腺癌多药耐药作用。（1）细胞生长曲线显示,化合物RY10-4对敏感株MCF-7细胞及耐药株MCF-7/ADR细胞均有生长抑制作用，和对照组阿霉素相比，RY10-4可显著抑制MCF-7/ADR细胞的生长；用流式细胞仪采用Annexin/PI染色法检测对乳腺癌细胞的凋亡，结果显示：RY10-4可显著诱导MCF-7/ADR细胞的凋亡。（2）MTT法体外分析检测乳腺癌多药耐药细胞对药物敏感性影响的结果显示：MCF-7/ADR细胞虽对ADR耐药但对RY10-4的细胞毒作用敏感，且RY10-4能够增强MCF-7/ADR细胞对化疗药物ADR的敏感性，改变耐药的状况。（3）罗丹明123外排实验结果显示：RY10-4能够增高细胞MCF-7/ADR内罗丹明潴留量和蓄积量，提示RY10-4可降低MCF-7/ADR细胞膜外排泵的药物转运功能；Western Blot实验技术检测P-gp蛋白，结果显示：RY10-4能够上调细胞MCF-7/ADR内P-gp蛋白的表达水平；Real-time PCR对MDR1基因的检测结果显示：RY10-4可以上调MCF-7/ADR细胞内MDR1基因的转录水平。（4）通过ATP水平检测实验显示：RY10-4可以抑制ATP酶活性，降低ATP的水平从而逆转多药耐药。（5）通过Western Blot及Real-timePCR方法对逆转耐药的相关信号通路蛋白检测发现：RY10-4通过抑制 PI3K/Akt/NF-κB信号通路调控MDR/P-gp介导的耐药型乳腺癌细胞MCF-7/ADR的多药耐药。（6）通过移植瘤模型发现：RY10-4可以体内逆转耐药型乳腺癌对阿霉素的抵抗，不论单用 RY10-4还是联用ADR均能使组织中的肿瘤细胞死亡，表现出强大的抗癌效应和逆转耐药效力。
　　结论：RY10-4作为原芹菜素类似物，一方面可抑制耐药的乳腺癌细胞增殖，诱导其凋亡，下调 ATP水平并抑制 P-gp的外排功能，另一方面可通过抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路，下调MDR1/P-gp的表达，逆转MCF-7/ADR的多药耐药，而且体内水平也可以抑制耐药型乳腺癌肿瘤组织的生长情况。因此，RY10-4在体内水平以及体外水平均表现出抗癌和逆转耐药的双重作用。在前期研究中，RY10-4的抗乳腺癌作用虽然已经做出了比较深入的研究，但本课题首次报道并验证了RY10-4具有逆转耐ADR乳腺癌的多药耐药作用，首次考察了RY10-4逆转耐药的分子机制，并且没有明显的毒副作用，在保证了强大的逆转耐药作用同时特保证了其应用的安全性，可以说RY10-4比传统的逆转剂维拉帕米（Verapamil）在逆转多药耐药方面有更明显的优势。我们的实验研究结果也提示了两个逆转多药耐药的潜在靶点：NF-κB及Akt。本实验的研究内容为RY10-4今后在临床上的抗癌运用（与化疗药联合使用或者单独使用）治疗肿瘤多药耐药提供了宝贵的指导基础。
　　第二部分：RY10-4体外抗肺腺癌活性研究
　　目的：本部分在体外水平研究RY10-4化合物抑制人源肺腺癌细胞A549的增殖作用，探究药物RY10-4在体外抗肺腺癌的药效活性，同时研究其抗肺腺癌药效活性所涉及的相关分子机制及信号通路。
　　方法：本实验选用人肺腺癌细胞株 A549，观察 RY10-4体外抗肺癌作用。（1）运用MTT法和台盼蓝拒染法研究RY10-4抑制A549细胞体外增殖的作用。（2）运用Annexin V/PI双染法并用流式细胞仪进行检测、Hoechst33258荧光染色法，同时研究RY10-4对诱导肺腺癌A549细胞凋亡的作用。（3）通过 PI染色法流式细胞仪分析 RY10-4对细胞周期的阻滞作用。（4）通过 Transwell法来评价 RY10-4对A549细胞体外侵袭能力的影响。（5）运用Western Blot实验方法检测RY10-4对凋亡侵袭相关蛋白及相关通路蛋白表达水平的影响。（6）用流式细胞仪检测RY10-4对活性氧自由基（ROS）的影响。
　　结果：RY10-4在体外表现出很强的抗肺腺癌活性。（1）RY10-4可以显著抑制A549细胞体外增殖活性。（2）RY10-4可以显著诱导 A549细胞凋亡，染色法中经过RY10-4处理过的细胞呈现出明显的凋亡细胞的形态特征，凋亡细胞比率增高，且经STAT3抑制剂AG490预处理可以显著促进RY10-4诱导的凋亡反应。（3）RY10-4处理后，细胞的G1期细胞比率显著增加。（4）当A549细胞使用不同浓度RY10-4干预后发现，能够透过聚碳酸酯膜的细胞也梯度性减少，说明A549的侵袭行为受到了RY10-4的明显抑制。（5）在RY10-4处理后的A549细胞中我们检测到，线粒体中的细胞色素 C向胞浆位置释放，线粒体凋亡途径被激活，P38、ERK信号传导通路被磷酸化活化。A549细胞被抑制剂预处理后，则发现U0126（ERK特异性抑制剂）及AG490（STAT3特异性抑制剂）明显地能够促进化合物RY10-4所诱导的细胞凋亡现象，而 SB203580（P38特异性抑制剂）则抑制了 RY10-4诱导的凋亡反应。（6）RY10-4处理后可显著增高ROS水平，且与U0126及AG490联用可进一步协同增高ROS水平，而联用SB203580则使ROS水平降低。
　　结论：本研究首次证实了RY10-4体外抗肺腺癌A549细胞的药效活性，并考察了其分子机制。RY10-4通过抑制增殖，促进凋亡，阻滞细胞周期进程，抑制侵袭作用发挥良好的体外抗肺癌活性，ERK和p38MAPK通路介导的STAT3/ROS途径是RY10-4诱导凋亡和抑制侵袭的重要机制。

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前言

第一章 RY10-4针对乳腺癌多药耐药的杀伤及逆转作用研究

第一节 RY10-4对乳腺癌多药耐药细胞MCF-7/ADR生长增殖的影响

第二节 RY10-4对乳腺癌多药耐药细胞MCF-7/ADR药物敏感性的影响

第三节 RY10-4对MCF-7/ADR细胞的MDR1/P-gp表达和功能的抑制作用

第四节 RY10-4对MCF-7/ADR细胞内ATP水平的影响

第五节 RY10-4逆转MCF-7/ADR细胞多药耐药的分子机制及信号通路研究

第六节 RY10-4对耐药型乳腺癌移植瘤的体内抗肿瘤作用

第二章 RY10-4体外抗肺腺癌作用的研究

第一节RY10-4体外抑制人肺腺癌细胞A549增殖活性的研究

第二节 RY10-4诱导A549细胞凋亡的检测

第三节 RY10-4对A549细胞周期的影响

第四节 RY10-4对A549细胞侵袭的影响

第五节 RY10-4介导A549凋亡侵袭的分子机制及信号通路研究

第六节 RY10-4对A549细胞活性氧自由基的影响

参考文献

全文小结及创新点

综述: 肿瘤多药耐药的研究进展

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