转录因子CTCF与长链非编码RNAMYCNOS协同促进神经母细胞瘤中MYCN表达的机制研究

摘要

第一部分转录因子CTCF促进神经母细胞瘤中MYCN基因表达
　　目的：寻找神经母细胞瘤中对MYCN基因进行转录调控的关键转录因子，并在神经母细胞瘤细胞株中检测其对MYCN基因表达水平的影响。
　　方法：通过综合分析基因表达谱芯片数据库R2 database、全基因组生物信息据库（UCSCGenome Bioinformatics）、转录因子结合位点分析平台Genomatix software MatInspector及基于染色质免疫共沉淀（ChIP）实验数据的ChIPBase和ChIP-X database，查找神经母细胞瘤中对MYCN基因进行转录调控的关键转录因子，同时定位其在MYCN基因启动子的结合位点，并通过双荧光素酶报告基因、实时定量PCR及western blot等实验方法检测其在神经母细胞瘤细胞株中对MYCN基因转录活性及表达水平的影响。
　　结果：通过多数据库及平台的综合分析，我们发现转录因子CTCF可能为调控MYCN基因表达的关键转录调控因子。在神经母细胞瘤细胞株中，过表达CTCF可以显著上调MYCN启动子报告基因的转录活性，并可显著上调MYCN转录本及蛋白水平的表达。而敲低CTCF则可显著下调MYCN启动子报告基因的转录活性，并显著下调MYCN转录本及蛋白水平的表达。对MYCN启动子报告基因中CTCF结合位点引入突变后，报告基因的转录活性显著下调，且过表达或敲低CTCF对突变后MYCN启动子报告基因转录活性的影响显著减弱。
　　结论：转录因子CTCF可以通过结合于MYCN基因启动子中的特异性结合位点，促进神经母细胞瘤细胞株中MYCN基因的转录活性及表达水平。
　　第二部分天然反义长链非编码RNA MYCNOS促进神经母细胞瘤中MYCN基因表达
　　目的：探讨天然反义长链非编码RNA MYCNOS在神经母细胞瘤中对MYCN基因表达水平的影响。
　　方法： RT-PCR方法检测MYCNOS五种不同变体在神经母细胞瘤组织标本及细胞株中的表达，筛选出神经母细胞瘤中稳定表达的变体。通过分析MYCNOS核糖体富集水平、对其潜在开放阅读框（open reading frame，ORF)引入突变及构建包含其开放阅读框的EGFP融合表达载体等方法探讨MYCNOS编码蛋白产物的可能性。并通过双荧光素酶报告基因、实时定量PCR及western blot等实验方法检测MYCNOS在神经母细胞瘤中对MYCN基因转录活性及表达水平的影响。
　　结果： RT-PCR方法检测结果表明，在不同神经母细胞瘤组织标本和细胞株中仅长度为770bp的MYCNOS转录本稳定表达。Ribosome Profile数据显示其核糖体富集水平极低；将MYCNOS-770 bp的开放阅读框与EGFP构建成融合表达载体后荧光观察及western blot实验均未检测到融合蛋白的表达。双荧光素酶报告基因、实时定量PCR及western blot等实验结果表明，神经母细胞瘤中MYCNOS-770bp可以显著上调MYCN基因的转录活性和表达水平。对MYCNOS-770 bp潜在开放阅读框引入不同突变使其不具备蛋白编码功能，并不影响其对MYCN基因转录活性及表达水平的调控。
　　结论： MYCNOS-770 bp转录本在神经母细胞瘤不同组织标本和细胞株中稳定表达。过表达MYCNOS-770 bp可以显著上调神经母细胞瘤中MYCN基因的转录活性及表达水平，且其对MYCN基因转录活性及表达水平的调控并不依赖于其是否具有蛋白编码功能。
　　第三部分转录因子CTCF与长链非编码RNA MYCNOS在神经母细胞瘤中的相互作用
　　目的：探讨转录因子CTCF与长链非编码RNA MYCNOS在神经母细胞瘤中的相互作用及二者相互协调对MYCN基因转录活性和表达水平的影响
　　方法：通过RNA与蛋白结合能力分析平台catRAPID分析转录因子CTCF与长链非编码RNA MYCNOS之间相互结合的可能性，并通过RNA免疫共沉淀及RNA pull-down实验方法检测CTCF与MYCNOS在神经母细胞瘤细胞内的相互结合及相互作用。通过RNA凝胶电泳迁移实验及In vitrobinding等实验方法检测CTCF与MYCNOS在体外的相互结合能力。进一步通过双荧光素报告基因、实时定量PCR及western blot实验方法检测CTCF与MYCNOS相互协同调控MYCN基因的转录活性及表达水平。
　　结果：catRAPID分析显示，转录因子CTCF与长链非编码RNA MYCNOS之间相互结合的可能性极高。RNA免疫共沉淀及RNA pull-down实验结果表明，在神经母细胞瘤细胞株中转录因子CTCF与长链非编码RNA MYCNOS之间的存在相互结合作用。RNA免疫共沉淀及RNA EMSA结果表明，MYCNOS的1号外显子区域及3号外显子区域可以与CTCF蛋白相互结合，2号外显子区域与CTCF结合力较低。利用CTCF重组蛋白进行in vtrobinding实验表明CTCF蛋白的锌指结构区域与MYCNOS结合力较高。双荧光素报告基因、实时定量PCR及western blot等实验结果表明CTCF可以与MYCNOS协同调控MYCN基因转录活性及表达水平，二者对MYCN转录活性及及表达水平的调控受彼此之间相互影响。
　　结论：在神经母细胞瘤中，转录因子CTCF可以与长链非编码RNA MYCNOS相互结合、相互作用，并协同调控神经母细胞瘤中MYCN基因的转录活性和表达水平。
　　第四部分长链非编码RNA MYCNOS促进CTCF募集于MYCN启动子并引起染色质重塑
　　目的：探讨长链非编码RNA MYCNOS与转录因子CTCF在神经母细胞瘤中协同调控MYCN基因转录活性和表达水平的分子机制
　　方法：染色质免疫共沉淀（ChIP）检测神经母细胞瘤中CTCF在MYCN基因启动子的富集情况，并检测MYCNOS对CTCF与MYCN基因启动子结合水平的影响。通过使用DNA甲基化酶抑制剂处理神经母细胞瘤细胞，探讨CTCF是否是通过调节MYCN基因启动子的甲基化水平来调控其转录活性。UCSC genome browser分析MYCN基因启动子区域的染色质状态，进一步通过染色质免疫共沉淀检测CTCF及MYCNOS对MYCN基因启动子染色质活化状态的影响。
　　结果：染色质免疫共沉淀实验表明，在神经母细胞瘤中转录因子CTCF可以结合于MYCN基因启动子中的特异性结合位点。MYCNOS可以促进CTCF在MYCN基因启动子结合位点的富集。DNA甲基化酶抑制剂处理不影响敲低 CTCF表达对MYCN表达水平的下调。UCSC分析显示MYCN基因启动子CTCF结合区域染色质活化标志物富集水平较高，而染色质抑制标志物富集水平较低。染色质免疫共沉淀实验结果显示，CTCF可以促进神经母细胞瘤中MYCN基因启动子染色质活化标志物组蛋白H3赖氨酸K4双甲基化（H3K4me2）、组蛋白H3赖氨酸K4三甲基化（H3K4me3）及RNA聚合酶Ⅱ的富集，并抑制染色质抑制标志物组蛋白H3赖氨酸K9三甲基化（H3K9me3）和组蛋白H3赖氨酸K27三甲基化（H3K27me3）的富集，而同时敲低MYCNOS则可削弱CTCF对MYCN启动子的染色质重塑功能。
　　结论：转录因子CTCF可以结合于MYCN基因启动子中的特异性结合位点，引发染色质重塑，促进染色质活化标志物富集，从而促进MYCN基因的转录活性及表达水平；MYCNOS则可以通过协助CTCF结合于MYCN基因启动子，从而发挥其促进MYCN基因转录及表达的功能。
　　第五部分 CTCF协同MYCNOS抑制神经母细胞瘤分化并促进其增殖、侵袭和转移
　　目的：探讨转录因子CTCF及长链非编码RNA MYCNOS在体外和体内对神经母细胞瘤细胞的增殖、侵袭、转移及分化能力的影响。
　　方法：建立稳定过表达/敲低CTCF及稳定过表达/敲低MYCNOS的神经母细胞瘤亚克隆细胞株，通过软琼脂克隆实验、流式细胞术及基质胶侵袭实验等方法检测不同处理后神经母细胞瘤细胞的增殖、侵袭活性变化；通过免疫荧光实验观察神经母细胞瘤中神经元分化标志物变化；建立神经母细胞瘤裸鼠皮下注射成瘤和尾静脉注射转移瘤动物模型，评估CTCF及MYCNOS对神经母细胞瘤体内增殖、侵袭及转移的影响。
　　结果：软琼脂克隆实验、流式细胞术及基质胶侵袭实验等实验结果表明，过表达MYCNOS可促进神经母细胞瘤在体外的增殖、侵袭活力并抑制其分化倾向，而敲低CTCF表达则可抑制神经母细胞瘤在体外的增殖、侵袭活力并促进其分化倾向，且敲低CTCF可削弱过表达MYCNOS对增殖、侵袭及分化的影响；过表达CTCF也可促进神经母细胞瘤在体外的增殖、侵袭活力并抑制分化倾向，敲低MYCNOS表达则可抑制神经母细胞瘤在体外的增殖、侵袭活力并促进分化倾向，且敲低MYCNOS可削弱过表达CTCF对增殖、侵袭及分化的影响。神经母细胞瘤裸鼠皮下注射及尾静脉注射移植瘤模型发现：与对照组相比，过表达CTCF可显著促进神经母细胞瘤在裸鼠模型中的肿瘤体积、重量及转移灶的发生，而敲低MYCNOS表达则显著抑制神经母细胞瘤在裸鼠模型中的肿瘤体积、重量及转移灶的发生，且敲低MYCNOS可削弱过表达CTCF对裸鼠模型中肿瘤体积、重量及转移灶的影响。
　　结论：CTCF可以协同长链非编码RNA MYCNOS促进神经母细胞瘤在体外和体内的增殖、侵袭及转移能力，并抑制神经母细胞瘤的分化倾向。
　　第六部分神经母细胞瘤组织标本及细胞株中CTCF及MYCNOS表达分析
　　目的：通过对神经母细胞瘤组织标本及细胞系中CTCF及MYCNOS的表达进行检测、分析，进一步明确CTCF及MYCNOS表达与MYCN表达、疾病进展及患者预后之间的相互关系。
　　方法：免疫组织化学、实时定量PCR及western blot等实验方法检测所收集的神经母细胞瘤组织标本及细胞株中CTCF、MYCNOS及MYCN的表达水平，并结合 R2数据库中的神经母细胞瘤组织标本基因表达谱芯片数据，分析 CTCF及MYCNOS表达与MYCN表达相关性，解析CTCF及MYCNOS的表达水平与肿瘤进展及患者预后的关系。
　　结果：免疫组织化学法检测神经母细胞瘤组织标本（n=42例）显示，CTCF蛋白主要定位于细胞核中，与MYCN蛋白表达呈一致性，在分化较差、核分裂指数较高、INSS（International Neuroblastoma Staging System）进展期及MYCN扩增型的NB组织标本中表达水平更高。NB组织标本及细胞株中的CTCF及MYCNOS的表达水平显著高于正常背根神经节细胞中的表达水平，且CTCF及MYCNOS转录本表达水平与MYCN转录本表达水平均呈显著正相关。R2数据库中88例NB标本中INSS4期、死亡组、MYCN扩增组及疾病进展组CTCF及MYCNOS的表达水平分别显著高于对照组。在R2数据库中88例、117例、101例NB组织标本及24例NB细胞株基因表达谱microarray数据集中，CTCF及MYCNOS转录本表达水平与MYCN转录本表达水平均呈显著正相关。对R2数据库中88例（microarray）和498例（RNA-seq）NB组织标本基因表达数据进行生存相关性分析显示，高表达CTCF或MYCNOS组预后显著差于低表达CTCF或MYCNOS组。对R2数据库中498例NB组织标本数据进行 Cox回归分析显示，CTCF高表达为神经母细胞瘤结局不良的独立预后因子。
　　结论：神经母细胞瘤组织标本及细胞株中CTCF及MYCNOS的表达与MYCN的表达呈显著正相关，CTCF或MYCNOS高表达与疾病进展及预后不佳相关。

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封面

声明

目录

主要专业名词缩写

中文摘要

英文摘要

前言

参考文献

第一部分 转录因子CTCF促进神经母细胞瘤中MCYN基因表达

1材料与方法

2 结 果

讨论

参考文献

第二部分天然反义长链非编码RNA MYCNOS促进神经母细胞瘤中MYCN基因表达

1 材料与方法

2 结 果

讨论

参考文献

第三部分 转录因子CTCF与长链非编码RNA MYCNOS在神经母细胞瘤中的相互作用

1 材料与方法

2 结 果

讨论

参考文献

第四部分长链非编码RNA MYCNOS促进CTCF募集于MYCN启动子并引起染色质重塑

1 材料与方法

2 结 果

讨论

参考文献

第五部分 CTCF协同MYCNOS抑制神经母细胞瘤分化并促进其增殖、侵袭和转移

1 材料与方法

2 结 果

讨论

参考文献

第六部分 神经母细胞瘤组织标本及细胞株中CTCF及MYCNOS的表达分析

1 材料与方法

2 结 果

讨论

参考文献

总结

综述: 神经母细胞瘤自发消退的回顾及展望

附录 攻读学位期间发表论文目录

致谢