抗氧化剂在梗阻性黄疸大鼠中枢神经系统氧化应激损伤中的应用研究

摘要

背景:梗阻性黄疸是指肝内胆管或肝外胆管等胆道系统发生机械性梗阻时，胆红素因胆汁向肠道的排泄受阻而返流入血所引起的黄疸。地卓西平马来酸盐（dizocilpinemaleate，MK-801）是一种非竞争性NMDA受体拮抗剂，大量研究结果证实MK-801对中毒、缺血缺氧、肝性脑病等多种情况下的神经元损伤具有保护作用。
　　白藜芦醇(resveratrol，Res)是在葡萄和红酒中大量存在的一种黄酮类多酚化合物，大量的体内和体外研究发现它有广泛的生物学效应和药学活性作用，如抵御活性自由基对机体细胞DNA的损伤并且防止细胞膜发生脂质过氧化反应等，并且已在心血管疾病、糖尿病、肾脏疾病等证实，发现白藜芦醇所产生的药理作用至少有部分是通过诱导HO-1的表达而发挥抗氧化应激损伤而进一步产生细胞保护作用的。
　　本实验首先建立梗阻性黄疸大鼠模型，再通过观察MK-801对梗阻性黄疸引起的大脑氧化应激反应中丙二醛(MDA)，总抗氧化能力(T-AOC)，超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)，核转录因子E2相关因子2(transcription factor NF-E2-related factor2,Nrf2)蛋白，Nff2 mRNA,血红素加氧酶-1（heineoxygenase-1，HO-1），NAD(P)H醌氧化还原酶1(NQO1，NAD(P)H quinone oxidoreductase1)等指标的影响，进而深入探讨NMDA受体阻滞剂对梗阻性黄疸所致大脑氧化应激损伤是否具有保护作用及其具体机制。论文第三部分主要通过白藜芦醇对梗阻性黄疸大鼠中枢神经系统内MDA，SOD及HO-1研究其在氧化应激损伤的过程中的作用。
　　第一部分 MK-801对梗阻性黄疸大鼠中枢神经抗氧化应激系统的影响
　　目的:本部分研究的目的在于成功建立梗阻性黄疸大鼠模型，并探讨MK-801对梗阻性黄疸大鼠中枢神经抗氧化应激系统的影响。
　　方法:20只大鼠随机分为四组:Ⅰ组（假手术组）、Ⅱ组（对照组）、Ⅲ组（低剂量处理组）和Ⅳ组（高剂量处理组），Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ组为梗阻性黄疸模型组，Ⅲ，Ⅳ组为MK-801组。第2天起Ⅲ组腹腔注射MK-801，0.025mg/kg·d，Ⅳ组腹腔注射MK-801，0.25mg/kg·d;Ⅰ组和Ⅱ组以等容量生理盐水同时注射。四组大鼠术后3d采尾部静脉血以全自动生化仪检查血清总胆红素和直接胆红素浓度来确定模型制作是否成功，术后10天处死大鼠并取材（大脑皮质）按试剂盒要求行MDA及CAT、T-SOD、T-AOC含量或活性测定。
　　结果:
　　1.假手术组实验鼠术后当日即恢复饮食及自由活动，且活动灵敏，小便淡黄。梗阻性黄疸模型组大鼠第2天开始出现尾尖及耳部等皮肤较薄的部位黄染，并逐渐出现全身黄染，尿液深黄，精神萎靡、反应迟缓。术后第三天，对照组、MK-801低剂量组、MK-801高剂量组大鼠大脑组织中直接胆红素的浓度和总胆汁酸含量（μmol/L）与假手术组相比明显增高，且有统计学差异(P＜0.01)，考虑梗阻性黄疸模型制作成功。
　　2.对照组、MK-801低剂量组、MK-801高剂量组丙二醛的含量与假手术组相比升高，且有统计学差异(P＜0.05)。应用MK-801后丙二醛含量与对照组相比降低，且具有统计学意义，但MK-801高、低剂量组之间无统计学差异（P＞0.05）。
　　3.对照组氧化氢酶活性与假手术组相比降低，MK-801组过氧化氢酶活性比对照组明显增高，且有统计学差异(P＜0.05)。MK-801低剂量组、MK-801高剂量组之间过氧化氢酶活性无统计学差异(P＞0.05)
　　4.对照组总超氧化物歧化酶活性比假手术组降低，且有统计学意义，MK-801组总超氧化物岐化酶活性与对照组相比明显增高，且有统计学差异(P＜0.05)。MK-801高剂量组总超氧化物岐化酶活性与低剂量组相比无统计学差异。
　　5.对照组、MK-801低剂量组、MK-801高剂量组总抗氧化能力与假手术组相比明显增高，且有统计学意义(P＜0.05)。MK-801组比对照组总抗氧化能力升高，但高剂量组与对照组之间相比无统计学差异(P＞0.05)。
　　结论:
　　1.通过结扎实验动物胆总管可以成功建立梗阻性黄疸动物模型。
　　2.梗阻性黄疸时中枢神经系统机体存在氧化应激反应，机体通过增加过氧化氢酶等抗氧化应激损伤酶类的表达使抗氧化应激损伤能力增强，这与国内外目前研究一致。
　　3.MK-801使梗阻性黄疸所致大鼠中枢神经系统氧化应激损伤的过程中脂质过氧化程度降低，并且可以提高SOD的活性及机体总抗氧化应激能力，高剂量的MK-801与低剂量的MK-801相比效果并未明显增加，反而使T-SOD活性比低剂量组降低，具体机制需要进一步研究。
　　第二部分 Keap1-Nrf2-ARE信号通路在梗阻性黄疸大鼠中枢神经系统氧化应激损伤中的作用探讨
　　目的:研究Keap1-Nrf2-ARE信号通路在梗阻性黄疸大鼠中枢神经系统氧化应激损伤中的作用及在机体氧化应激反应过程中NMDA受体阻滞剂对Keap1-Nrf2-ARE信号通路的影响
　　方法:四组大鼠分别为:Ⅰ组（假手术组）、Ⅱ组（对照组）、Ⅲ组（低剂量处理组）和Ⅳ组（高剂量处理组），Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ组为梗阻性黄疸模型组，第2天起Ⅲ组腹腔注射MK-801，0.025mg/kg.d，Ⅳ组腹腔注射MK-801，0.25mg/kg.d，连续注射10d;Ⅰ组和Ⅱ组以等容量生理盐水同时注射。术后10天取材以Western bolt行HO-1，NQO1，Nrf2蛋白，以RT-PCR行Nrf2 mRNA测定。
　　结果:
　　1.与假手术组相比，OJ组Nrf2 mRNA表达均明显升高，且均有统计学差异，P＜0.05。MK-801组与对照组相比Nrf2 mRNA表达升高且有统计学意义，P＜0.05。高剂量组与对照组相比Nrf2 mRNA表达降低，但无统计学差异，P＞0.05。
　　2.与假手术组相比，OJ组Nrf2蛋白表达均增高，且有统计学意义，P＜0.05; MK-801组与对照组相比Nrf2蛋白表达增高，且有统计学意义，P＜0.05。不同的是高剂量组与低剂量组相比Nrf2蛋白表达减低，而且具有统计学意义，P＜0.05。
　　3.OJ组与假手术组相比HO-1蛋白表达增高，且有统计学意义，P＜0.05。MK-801组与对照组相比HO-1蛋白表达增高，且有统计学意义，P＜0.05。高低剂量MK-801组比低剂量组相比，HO-1表达水平降低，且具有统计学差异P＜0.05。
　　4.OJ组与假手术组相比NQO1蛋白表达增高，且有统计学意义，P＜0.05。MK-801组与对照组相比NQ01蛋白表达增高，且有统计学意义，P＜0.05。高低剂量MK-801组比低剂量组相比，NQO1表达水平降低，且具有统计学差异P＜0.05。
　　结论:
　　1.再一次验证梗阻性黄疸时机体存在氧化应激反应。
　　2.机体通过Keap1-Nrf2-ARE信号通路增强了HO-1和NQO1及Nrf2蛋白的表达，增强了自身抗氧化应激能力。
　　3.NMDA受体阻滞剂MK-801通过Keap1-Nrf2-ARE信号通路上调了Ⅱ相解毒酶HO-1和NQO-1的蛋白表达，增加了机体抗氧化应激反应能力，从而发挥了它的神经保护作用。虽然高、低剂量的MK-801均能达到此作用，但高剂量的MK-801反而使Nrf2 mRNA、Nrf2蛋白、HO-1和NQ01蛋白的表达较低剂量组降低，可能与MK-801毒性作用有关。
　　第三部分 不同水平白藜芦醇对梗阻性黄疸大鼠中枢神经系统氧化应激损伤的影响
　　目的:通过对研究梗阻性黄疸大鼠大脑皮质中氧化应激指标表达水平来探讨不同水平白藜芦醇对梗阻性黄疸大鼠中枢神经系统氧化应激损伤的影响及其氧化应激损伤中的保护作用和机制。
　　方法:选择32只6周龄的雄性SD大鼠作为实验对象，将其随机分为四个组别，分笼饲养，每组8只，A组大鼠进行梗阻性黄疸假手术（只将胆总管游离出来，不做结扎），B、C、D组大鼠均进行手术制备梗阻性黄疸模型，术后每日C、D两组大鼠分别给予不同剂量的白藜芦醇溶液灌胃，A、B组则给予同等剂量生理盐水灌胃。分别在手术后的第14d采集血液标本行总胆红素、直接胆红素、谷丙转氨酶、谷草转氨酶测定，并采集大脑皮质标本，并对其中中丙二醛、超氧化物歧化酶活性、HO-1水平进行检测，观察不同组别的大鼠各项指标之间的差异。
　　结果:术后TBIL及DBIL指标结果证明Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ三组大鼠梗阻性黄疸模型制作成功。OJ组ALT、AST、MDA水平比假手术组升高，SOD、HO-1水平比假手术组降低。OJ组内反应肝功能损害指标ALT，AST及反应氧化应激损伤指标MDA的平均水平呈Ⅱ＞Ⅲ＞Ⅳ的趋势，而氧化应激保护性指标SOD和HO-1平均值则呈Ⅱ＜Ⅲ＜Ⅳ的趋势，且具有统计学意义。不同剂量的白藜芦醇组之间，指标相比也存在统计学差异(P＜0.05)。
　　结论:白藜芦醇对梗阻性大鼠TBIL及DBIL影响不大，但可以保护其肝功能，并且可以能促进大脑皮质细胞组织中的丙二醛含量降低、SOD和HO-1活性升高，发挥抗氧化应激损伤的作用。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 MK-801对梗阻性黄疸大鼠中枢神经抗氧化应激系统的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 Keap1-Nrf2-ARE信号通路在梗阻性黄疸大鼠中枢神经系统氧化应激损伤中的作用探讨

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 不同水平白藜芦醇对梗阻性黄疸大鼠中枢神经系统氧化应激损伤的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 NMDA受体及其阻滞剂在梗阻性黄疸大鼠中枢神经系统氧化应激过程中的作用

致谢

个人简历