利用噬菌体肽库筛选肺癌NCIH1299细胞特异性多肽ZP1及其配体periplakin的研究

摘要

背景： 抗体技术已经由细胞工程抗体发展到了基因工程抗体。噬菌体抗体、多肽库、肽库技术的出现及噬菌体抗体、多肽的研制成功已成为抗体研究领域的突破性进展之一，该技术被誉为抗体技术的第三次革命。 噬菌体抗体、多肽库（phage antibody library）技术是通过PCR方法将全套抗体重链和轻链可变区基因克隆出来，克隆至噬菌粒载体上，抗体片段与噬菌体的外壳蛋白以融合蛋白的形式表达在噬菌体的表面。噬菌体展示技术建立随机肽库的方法是：通过化学合成的方法，随机合成特定长度肽的寡核苷酸片段，然后通过基因工程重组技术插入至噬菌体载体的外壳蛋白编码基因中并转化大肠杆菌，增殖和产生的噬菌体其表面携带有外源多肽，每个噬菌体表面表达一种外源肽，所有这些噬菌体构成随机肽库。利用目标分子从整个噬菌体随机肽库中经筛选—扩增—筛选等步骤，最后获得能与靶分子高亲和力结合的噬菌体克隆。通过测定该噬菌体的DNA序列后，就可知道噬菌体所携带的多肽氨基酸序列。 噬菌体抗体、肽库技术由两大核心内容组成：①利用丝状噬菌体或噬菌粒作为表达载体，通过基因工程重组技术将外源随机合成的DNA片段插入噬菌体外壳蛋白编码基因中，并在噬菌体表面展示该外源DNA所编码的多肽；②利用目标靶分子如抗体、受体蛋白等，在噬菌体随机肽库中与展示在噬菌体表面的多肽发生特异性结合，再通过有效的亲和淘选方法，筛选出高亲和力结合多肽的表达噬菌体。因为在噬菌体表面表达的抗体、多肽片段具有与抗原结合的生物学活性，因此，可以用亲和层析的方法从噬菌体抗体、多肽库中筛选出目的噬菌体抗体、多肽，并可获得特异性噬菌体抗体、多肽的基因。获得目的噬菌体可感染合适的大肠杆菌进行分泌型表达，再采用蛋白质L—琼脂糖通过亲和层析方法纯化出具有与抗原结合活性的单链抗体。这一技术将抗体的表型和基因型联系起来，因而使识别抗原的能力与进行再扩增的能力结合在一起，模拟生物体内B淋巴细胞的有关特性——识别与扩增的统一，因而是一种极为高效的表达和筛选抗体的体系。 噬菌体抗体、多肽库技术是以基因工程技术来生产抗体，它的出现使传统的以细胞工程技术制备单克隆抗体的方法完全改观，与杂交瘤技术相比它具有以下的优点：（1）方法简单、快速：从淋巴细胞中提取mRNA到构建抗体库，继而筛选出目的噬菌体抗体、多肽，整个过程一般只需要几周的时间，而杂交瘤技术从脾细胞融合到获得稳定的单克隆抗体细胞株至少需数月。（2）不需要实验动物或大量的细胞培养就可生产抗体。（3）可以绕过免疫制备抗体：由于人淋巴细胞库中天然存在针对各种抗原的特异性细胞，可以直接利用人外周血淋巴细胞构建“天然抗体库”，筛选出目的噬菌体抗体、多肽，使制备全人抗体成为可能，尤其是制备自身抗原和其他弱免疫原性抗原的抗体具有独到的优势。（4）可以对抗体基因进行改造，在体外通过基因突变、链更替等技术，可进一步提高抗体的亲和力和稳定性。（5）可以制备多克隆抗体：对抗体库进行筛库时，最初得到的是多克隆重组噬菌体抗体、多肽。将该多克隆抗体用于诊断可提高敏感度，用于治疗可提高疗效，也是分子识别、抗原表位研究的理想工具。（6）可大规模生产，成本低：抗体片段可在大肠杆菌中进行分泌型表达，易于分离纯化出有生物学活性的抗体分子，通过发酵大量生产。克服了杂交瘤细胞通过单克隆抗体腹水或大规模细胞培养来制备抗体的局限性。（7）噬菌体抗体、多肽的保存和传代稳定，而杂交瘤细胞株在传代过程中则有明显的不稳定性。 噬菌体肽库技术实际上是通过噬菌体展示技术将一定长度的所有外源多肽展示于噬菌体载体表面，实现基因表达产物与亲和筛选相结合的一种技术。以噬菌体为载体，把一段特定长度、随机合成的基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质（如pⅢ和pⅧ）N端的编码基因中，使这段基因编码的相应外源多肽在噬菌体外壳蛋白的N端以融合蛋白的方式表达并展示于噬菌体颗粒的表面，而且这种插入的外源多肽不影响和干扰噬菌体的生活周期，同时能够保持其天然构象，可以被相应的抗体或受体等靶分子所识别。同时，由于这段特定长度的基因是随机合成的，从理论上讲这段基因所编码的相应多肽应该包含自然界中这个长度肽的所有序列，这样就构成了一个特定长度的多肽库，而且库容量极大。进而可以利用靶分子，通过适当的亲和富集即生物淘选（biopanning）方法即“亲和吸附—洗脱—回收—扩增”多轮亲和筛选富集过程，洗去未吸附的或非特异结合的噬菌体，就可以从这个肽库中筛选到与靶分子特异性结合、表达有目的肽的噬菌体，经过感染大肠杆菌后可以大量扩增。另外，外源多肽展示在噬菌体的表面，但其编码基因位于病毒单链基因中，可通过对噬菌体的DNA测序推导出来，因此这种方式将多肽的表型与基因型密切联系在一起，实现了表型和基因型的转换。 近年来，随着噬菌体抗体、多肽库、肽库技术的不断发展，人们正在广泛应用该技术研制备种抗体片段。其中，因单链抗体具有许多优点而成为噬菌体抗体、多肽研究的热点。单链抗体（Single chain variable fragment，ScFv）是由抗体轻链可变区和重链可变区通过一接头（Linker）连接而组成的，是目前报道最多的一类小分子抗体片段，其分子量仅为完整抗体分子的六分之一，而且还有容易进入病灶组织的周围循环及在肾内清除快等优点，在疾病的诊断和治疗方面已引起广泛重视。此外，由于单链抗体缺少抗体Fc段，只识别靶抗原，不与具有Fc受体的非靶细胞结合，因此在体内定位诊断时背景低、图像清晰，在某些疾病的体内定位诊断方面也具有无可比拟的优点以及巨大的潜在价值。 肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，也是致死率最高的恶性肿瘤。欧洲每年新诊断的病例超过20万，约占所有肿瘤死亡人数的20％，男性死亡人数的28％。目前肺癌的主要治疗手段是外科手术，进展期肺癌手术后5年生存率不到10％。肺癌总生存率在过去的20年中无明显提高，约14％。而在过去的30年中，乳腺癌、结肠癌、前列腺癌等生存率大大提高了，其中一个重要原因是早期诊断。因此，要提高肺癌患者的生存率，早期诊断尤其重要。 目的： 1、通过噬菌体抗体、肽库技术，以肺癌NCI H1299为抗原筛选并鉴定非小细胞肺癌特异性结合多肽。 2、进一步利用筛选到的特异性多肽寻找新的非小细胞肺癌肿瘤标志物。 方法： 1、以肺癌细胞株NCIH1299为抗原，从商业公司购买经过鉴别的噬菌体12多肽库。 2、将肺癌细胞贴壁培养，利用亲和吸附原理，将噬菌体肽库经过4轮的吸附—洗涤—洗脱—富集的淘洗过程，经ELISA方法从富集的噬菌体多肽中筛选出特异性的抗肺癌细胞的噬菌体多肽。 3、将筛选出的结合肺癌的噬菌体多肽克隆，提取、纯化噬菌体质粒，DNA测序，合成多肽，标记荧光素，以ELISA和免疫组织化学方法对肺癌细胞和MRC—5正常肺细胞进行初步特异性结合鉴定。 4、肺癌特异性结合多肽竞争性抑制试验，将为标记的合成多肽与噬菌体竞争抑制，计算噬菌体克隆，确定其特异性。 5、以特异性结合多肽为探针筛选人肺癌cDNA文库，“钓取”肺癌特异性抗原——肺癌肿瘤新标志物。 结果： 1、以肺癌NCI H1299为抗原，从构建好的噬菌体多肽库进行4轮“吸附—洗涤—洗脱—扩增”的淘洗，挑选出9个经ELISA方法鉴定的特异性肺癌结合阳性的噬菌体多肽克隆。 2、全部提取噬菌体质粒、测序，结果表明，我们获得了9个特异性结合多肽，并且其中一个多肽的亲和力最高（ZP1），其氨基酸序列为HNKHLPSTQPLA（已经申请专利、受理中），通过化学方法合成该多肽，其中一部分标记荧光素FITC。 3、利用荧光标记多肽，经细胞荧光和免疫化学证实，ZP1的特异性和亲和力较高，为肺癌特异性最强结合多肽。 4、ZP1多肽与含ZP1多肽的噬菌体竞争性抑制试验，表明ZP1具有较强的亲和力和特异性，这说明我们筛选到的ZP1是特异性地结合在肺癌细胞上的。 5、以特异性结合多肽ZP1标记荧光素FITC为探针筛选人肺癌cDNA文库，“钓取”肺癌特异性抗原——肺癌肿瘤新标志物，我们成功获得了细胞膜蛋白——periplakin。 结论： 1、以NCI H1299为抗原，从噬菌体12多肽库中成功筛选出结合肺癌特异性抗原的特异性噬菌体克隆9个，并成功地鉴别其结合肺癌抗原的特异性。 2、发现了ZP1序列为一全新的多肽，利用体内外特异性噬菌体克隆（含ZP1的噬菌体）和标记荧光素FITC的多肽ZP1，发现ZP1具有高度的肺癌抗原结合特异性。 3、竞争性抑制试验进一步验证了我们的结果，即多肽ZP1肺癌抗原结合的特异性。 4、以多肽ZP1为探针，筛选肺癌cDNA文库成功筛选了ZP1结合的肺癌抗原，periplakin。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写词简表

声明

引 言

综述：肺癌早期诊断标志物的研究进展

第一章肺癌特异性噬菌体多肽的体内筛选

引言

材料与方法

实验结果

讨论

第二章人肺癌组织特异性结合重组噬菌体的鉴定

引言

材料与方法

实验结果

讨论

第三章肺癌高亲和力噬菌体外源多肽序列的测定及生物信息学分析

引言

材料与方法

实验结果

讨论

第四章多肽ZP1对肺癌的亲和力和特异性鉴定

引言

材料与方法

实验结果

讨论

第五章肺癌特异性多肽相关抗原肿瘤标志物的研究

引言

材料与方法

方法

实验结果

讨论

小 结

参考文献

附录

致谢