人脐带间充质干细胞分离扩增方法的优化及其免疫学特性

摘要

间充质干细胞(Mesenchymalstemcells，MSCs)是来源于中胚层的一类非造血干细胞，具有高度自我更新能力和多向分化潜能，在适宜条件下可分化为多种组织细胞。MSCs来源广泛，除骨髓外还可从脂肪、脐带血、胎盘与脐带等组织中分离获取。MSCs具有低免疫原性、调节免疫、易于转染外源基因、炎症趋化等特性，使其成为细胞靶向治疗，诱导移植免疫耐受的理想材料。MSCs不受MHC配型的限制，生物安全性较高，具有广泛的临床应用前景，已成为组织再生工程学及细胞免疫抑制剂领域研究的热点。
　　 不断探寻和改进MSCs获取的来源和方法，是深入研究和利用MSCs的必要前提。脐带为分娩废弃物，来源丰富，取材简单无痛苦，不受伦理道德限制；且MSCs含量丰富，扩增能力较骨髓更强，病毒感染率低。这些优点使脐带源MSCs日益成为研究的热点。
　　 第一部分人脐带间充质干细胞分离扩增方法的优化及其特性鉴定人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)是一种新型MSCs来源，目前分离提取的方法主要有：植块法、脐静脉内膜消化法、联合酶序贯消化Wharton'sJelly组织法等方法。我们总结以上方法的优缺点，并加以尝试，最终建立了Ⅰ型胶原酶联合透明质酸酶消化Wharton'sJelly组织的方法，并摒弃了胰蛋白酶序贯消化的方法。分离提取6跟脐带，成功率100％。
　　 对于hUC-MSCs的扩增，我们采用了LG-DMEM与MesenPro等比例混合培养基的体系，即保证了hUC-MSCs高效稳定的扩增，又相对节约了成本。该体系较一般的LG-DMEM完全培养基体系，能很好的保持细胞形态和更为高效的扩增速率。原代培养平均时间为13.83±1.21天，再经12天连续扩增可获得108数量级细胞，为MSCs的研究和应用提供有力保证。
　　 采用该分离扩增方法可获取高纯度的hUC-MSCs，经鉴定，其免疫表型与BM-MSCs基本相同，且可成功诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。
　　 第二部分人脐带间充质干细胞对T细胞体外活化增殖和细胞因子分泌的影响
　　 MSCs具有免疫抑制作用，在动物移植模型的抗排斥和治疗造血干细胞移植所致的GVHD中已初见成效。体外实验中MSCs可抑制多种免疫细胞，可抑制多种刺激诱导的T淋巴细胞增殖，但其机制尚不完全清楚，许多研究结果间还存在冲突。hUC-MSCs在此方面的研究较少，而与经典BM-MSCs的比较则更少。
　　 在该部分，我们观察了hUC-MSCs对PHA刺激的PBLs增殖的影响，用BrdU掺入的化学发光法进行抑制率定量测定并与hBM-MSCs比较。发现两种来源的MSCs均可显著抑制T细胞增殖，抑制效果与MSCs数量呈正相关，但hUC-MSCs的抑制作用略弱于BM-MSCs[1∶5(MSCs：PBLs)组，抑制率55.11％VS.70.96％，P＜0.05]。另外，MSCs还可促进PMA刺激的PBLs分泌IL-4、IL-10、IFN-γ3种细胞因子，某些情况下hUC-MSCs的促进作用强于hBM-MSCs；而IFN-γ的上调，尚与多数研究矛盾，有待进一步探讨。
　　 结论：我们优化了hUC-MSCs高效的分离扩增体系，经鉴定所得hUC-MSCs的生物及免疫学特性与hBM-MSCs类似，为将来成体干细胞的临床应用提供可靠的MSCs新来源。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分 人脐带间充质干细胞分离扩增方法的优化及其特性鉴定

1.1前言

1.2材料

1.3方法

1.4结果

1.5讨论

1.6小结

参考文献

第二部分 人脐带间充质干细胞对T细胞体外活化增殖和细胞因子分泌的影响

2.1前言

2.2材料

2.3方法

2.4结果

2.5讨论

2.6小结

参考文献

全文总结

附录

附录一、综述 间质干细胞在移植免疫中的研究进展

附录二　缩略词

附录三　硕士期间撰写和发表的论文

致谢