基于悬浮细胞培养的大麦耐镉性基因型差异及大小麦耐渗透胁迫差异的机理研究

摘要

镉(Cadmium，Cd)是毒性最强的重金属污染元素之一。Cd在环境中的迁移性强，极易被植物吸收积累，超过一定限度不仅严重影响作物生长发育，降低其产量和品质，而且能通过食物链富集，危害人体健康。因此，研究Cd的植物毒性机制，以及植物对Cd胁迫的应答机制，对于提高植物对Cd的抗/耐性，改良粮食作物品质，降低Cd从植物进入食物链的危险性，具有十分重要的理论和实践指导意义。 目前，Cd胁迫对植物生理生化影响的研究大多集中在植株水平上进行，而细胞生理生化对Cd胁迫是如何反应这一研究领域的探索却相对较少。悬浮细胞具备很好的均一性，并且对环境胁迫的反应更为敏感和直接。 为此，本研究以耐Cd性不同的大麦基因型(萎缩不知，耐Cd基因型；东17，Cd敏感基因型)为材料，在成功建立分散均匀、稳定的胚性悬浮细胞系的基础上，较为系统地研究了Cd胁迫对大麦细胞抗氧化系统的影响及其基因型差异；并进一步探讨了饲喂Zn、Fe、GSH和SA对大麦细胞Cd毒害的缓解效应与基因型差异及其生理生化机制。此外，我们还培育了大麦(PC1163)和小麦(PC998)悬浮细胞系，并采用24孔板培养方法，研究了盐(NaCl处理)和干旱(PEG处理)胁迫对细胞生长和渗透调节物质脯氨酸含量的影响，并从基因表达水平探讨了大小麦耐渗透胁迫差异的机理。主要研究结果如下： 1.以直径约2mm的幼胚为外植体，建立了萎缩不知和东17两个大麦基因型的稳定均质的悬浮细胞系，初步研究了大麦悬浮细胞的生长特性，探讨了不同水平Cd胁迫对细胞活力的影响及基因型差异。结果表明，大麦悬浮细胞的生长可以明显分为3个阶段：迟滞期(0-3d)、指数生长期(4-8d)、静止期(9-12d)，由此进一步确定了大麦细胞的最佳继代周期为7-8d。大麦悬浮培养液pH值的变化与细胞的生长阶段存在一定的相关性，pH值变化的基本趋势是先迅速下降，再缓慢上升，最后稍有下降。随着Cd处理时间的延长和浓度的加大，大麦细胞活力逐步下降，通过细胞活力及MDA含量两项指标的测定比较，我们确定了Cd胁迫浓度50μM，处理时间5d，作为后继生理生化研究的试验处理条件。 2.研究了不同浓度Zn、Fe对Cd胁迫下大麦细胞活力和抗氧化酶活性的影响及基因型差异。结果表明，Cd胁迫会导致大麦细胞活力下降、MDA含量上升，敏感基因型东17细胞较耐性基因型萎缩不知细胞受害严重。50μMCd胁迫下，耐性细胞系萎缩不知的SOD、POD活性显著增强，但CAT活性受到抑制。敏感细胞系东17的SOD、CAT活性在Cd处理ld后有所上升，但处理5d后，活性显著下降；而POD活性在整个处理时期内均显著高于对照。缺Zn处理和缺Fe处理显著降低了Cd胁迫下大麦细胞活力，并导致MDA含量剧烈升高；同时也使得SOD、POD、CAT活性急剧下降。而300μMZn和500μMFe在一定程度上缓解了Cd胁迫对大麦细胞造成的氧化损伤，诱导大麦细胞抗氧化酶活性(SOD、POD、CAT)较单独Cd处理上升，同时MDA含量有所下降。 3.探讨了外源GSH和SA对Cd胁迫下大麦细胞抗氧化系统的影响及基因型差异。结果表明，50μMCd胁迫诱导耐性基因型萎缩不知大麦细胞APX、MDHAR活性显著提高，在处理中后期GR、DHAR活性也显著上升；而敏感基因型东17在50μMCd胁迫下仅MDHAR活性显著增强，至处理中后期尽管GR活性有所上升，但APX活性显著下降，且DHAR活性在整个处理时期内均受到抑制。尽管50μMCd胁迫降低了两基因型大麦悬浮细胞GSH、AsA含量，并且细胞内GSH/GSSG、AsA/DHA比值亦较对照有所下降，但耐性较强的萎缩不知胞内的GSH、AsA含量及GSH/GSSG、AsA/DHA水平较东17高。外源GSH和SA降低了Cd胁迫对大麦细胞造成的氧化伤害，使得大麦细胞MDA含量较单独Cd处理有所下降，而细胞活力稍有上升。外源GSH显著提高了Cd胁迫下两基因型大麦细胞APX、MDHAR活性及内源GSH含量和GSH/GSSG比率；而外源添加SA显著提高了两个大麦细胞系GSH含量和GSH/GSSG比率，同时对萎缩不知大麦细胞SOD等抗氧化保护酶、AsA-GSH循环关键酶类以及AsA、AsA/DHA比率也有一定的促进作用。 4.以大麦(PC1163)和小麦(PC998)悬浮细胞系为试验材料，采用24孔板培养方法，探讨了盐和干旱胁迫对细胞生长和渗透调节物质脯氨酸含量的影响，并进一步从基因表达水平探讨了大小麦耐渗透胁迫差异的机理。结果表明，大麦(PC1163)和小麦(PC998)细胞对渗透胁迫的耐性存在差异，其中大麦悬浮细胞对渗透胁迫的耐性较强。100mMNaCl处理24h后，小麦(PC998)悬浮细胞系中的活细胞量显著下降，而大麦细胞则无显著变化。脯氨酸是禾本科植物细胞中重要的渗透调节剂之一，大小麦细胞中脯氨酸含量的分析结果显示，小麦(PC998)细胞中的脯氨酸水平为大麦(PC1163)细胞的3倍。NaCl胁迫下，两种类型细胞的脯氨酸含量均随处理时间的增加而升高；而PEG处理后，细胞内脯氨酸水平的增幅较小。 本试验以Tubulin为内参，通过半定量RT-PCR检测分析了渗透胁迫下脯氨酸生物合成关键基因(P5CS和P5CR)在转录水平上的变化。NaCl和PEG处理下，小麦(PC998)细胞P5CS和P5CR的转录水平随胁迫时间的变化趋势与其游离脯氨酸含量测定值的变化较为一致；但在大麦(PC1163)细胞中并未得到相同的结果，NaCl和PEG处理下，大麦(PC1163)细胞中P5CS和P5CR的转录水平无显著变化，但其脯氨酸含量却随处理时间的延长而上升。进一步分析结果发现，大麦(PC1163)细胞中P5CS和P5CR的转录水平较小麦(PC998)高，而大麦(PC1163)细胞中的脯氨酸含量却显著低于小麦(PC998)细胞。 由此推测，大麦(PC1163)细胞中脯氨酸生物合成总体水平较高，但大麦细胞中的脯氨酸具有较高的流通能力。而大麦(PC1163)细胞醇溶蛋白4个同源基因的转录水平的检测结果也证实了这一点，游离脯氨酸参与合成B3-Hordein，在降低细胞内脯氨酸含量并维持脯氨酸动态平衡方面起了重要作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:图表目录、缩略词表

声明

致谢

第一章 文献综述

1植物细胞培养的研究进展

1.1植物悬浮细胞培养研究概况

1.2影响植物悬浮细胞系建立的因素

1.3植物悬浮细胞系在逆境生理研究的应用

2镉(Cd)对植物毒害及植物耐镉机理研究进展

2.1 Cd对植物的毒性效应

2.2植物对Cd的耐性机制

3外源物质缓解重金属Cd胁迫的研究进展

3.1锌(Zn)

3.2铁(Fe)

3.3谷胱甘肽(GSH)

3.4水杨酸(SA)

4本实验的研究目的和意义

参考文献

第二章 不同耐镉性大麦基因型悬浮细胞系的构建及镉胁迫对细胞活性的影响

1材料与方法

1.1大麦悬浮细胞系的建立

1.2大麦悬浮细胞生长量及pH的测定

1.3不同浓度Cd胁迫对大麦细胞活性的影响

2结果与分析

2.1大麦悬浮细胞系的建立

2.2大麦悬浮细胞系的生长特性

2.3不同浓度Cd胁迫对大麦细胞活性的影响

3讨论

参考文献

第三章 锌、铁对镉胁迫下大麦悬浮细胞生长和抗氧化酶活性的影响及基因型差异

1材料与方法

1.1细胞培养及处理

1.2分析测定方法

1.3统计分析

2结果与分析

2.1不同浓度Zn和Fe对Cd胁迫下大麦悬浮细胞活力的影响及基因型差异

2.2不同浓度Zn和Fe对Cd胁迫下大麦细胞膜脂过氧化的影响及基因型差异

2.3不同浓度Zn和Fe对Cd胁迫下大麦细胞抗氧化酶活性的影响及基因型差异

3讨论

参考文献

第四章 外源GSH和SA对镉胁迫下大麦悬浮细胞生长和抗氧化系统的影响及基因型差异

1材料与方法

1.1细胞培养及处理

1.2分析测定方法

1.3统计分析

2结果与分析

2.1外源GSH和SA对Cd胁迫下大麦悬浮细胞活力的影响及基因型差异

2.2外源GSH和SA对Cd胁迫下大麦细胞膜脂过氧化的影响及基因型差异

2.3外源GSH和SA对Cd胁迫下大麦细胞SOD、POD和CAT活性的影响及基因型差异

2.4外源GSH和SA对Cd胁迫下大麦细胞AsA-GSH循环相关抗氧化酶活性及抗氧化剂含量的影响及基因型差异

3讨论

参考文献

第五章 大麦(PC1163)和小麦(PC998)悬浮细胞系的构建及其耐渗透胁迫差异的机理

1材料与方法

1.1细胞培养及处理

1.2分析测定方法

2结果与分析

2.1小麦和大麦单细胞培养体系的建立

2.2 NaCl和PEG处理对小麦(PC998)和大麦(PC1163)细胞活力的影响

2.3 NaCl和PEG处理对小麦(PC998)和大麦(PC1163)悬浮细胞脯氨酸含量的影响

2.4 NaCl和PEG处理对小麦(PC998)和大麦(PCIl63)细胞P5CS和PSCR转录水平的影响

2.5 NaCl和PEG处理对大麦(PC1163)悬浮细胞醇溶蛋白编码基因转录水平的影响

3讨论

参考文献

攻读博士学位期间发表或录用的论文